Genome-wide analysis of the effect of bacilysin biosynthetic operon in Bacillus subtilis
Bacillus subtilis'de basi̇li̇si̇n bi̇yosentez operonunun etki̇leri̇ni̇n genom ölçeği̇nde anali̇zi̇
- Tez No: 363686
- Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2013
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 158
Özet
Bacilysin is a dipeptide antibiotic synthesized by certain Bacillus strains. It is composed of two aminoacids, L-alanine and L-anticapsin, an unusual non-proteinogenic substance. It is active against a wide range of bacteria and fungi. The antimicrobial effect of bacilysin comes from its anticapsin moiety. A polycistronic operon bacABCDEF (formerly ywfBCDEFG) and a monocistronic gene ywfH are responsible for the biosynthesis of bacilysin in Bacillus subtilis. While BacA, BacB, YwfG and YwfH take role in the anticapsin production in the bacilysin producer, BacD is responsible for the ligation of L-alanine and L-anticapsin. The bacE gene product provides self protection against bacilysin.. Bacilysin production in B.subtilis is positively regulated by quorum-sensing regulatory circuits involving the regulatory proteins encoded by comP, comA, comQ, spo0H, oppA, phrK, phrF and phrC genes at the transcriptional level. The loss of bacilysin production in spo0A-blocked mutants as well as an increase in the production of bacilysin in abrB-disrupted mutants and the suppression of bacilysin-negative phenotype by an abrB mutation in spo0A-blocked mutants reveals that the transcription of biosynthetic and regulatory genes involved in bacilysin formation is under the negative control of AbrB which is relieved by Spo0A protein. Besides to AbrB, CodY and ScoC negatively regulate bacilysin production. Furthermore, A GntR type regulatory protein,encoded from a novel gene, yvfI is also essential for bacilysin biosynthesis. In the present study it was focused on the elucidation of the functional role of bacilysin in the host organism. For this, we performed a genome-wide comparative transcriptome analysis of the wild type strain PY79, as a natural bacilysin producer, and its bacilysin non-producer derivative strain OGU1 (bacA::lacZ::erm) during logarithmic phase (~OD600 0,7) and stationary phase (~ OD600 7). This evaluated microarray data was further confirmed with quantitative analysis of expression of many genes and operons that were identified to be induced or repressed during logarithmic and stationary growth phases by using reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR). As a result, bacilysin affected genes were found to be involved in various cellular processes such as competence development, biofilm formation, development of sporulation; membrane bioenergetics (biosynthesis of coenzymes and prosthetic groups), transportations, adaptation to atypical conditions, detoxification and intermediary metabolisms like carbohydrate, nitrogen, lipid and sulfur metabolisms. Thus, all these results strongly suggested that bacilysin has a significant regulatory role in the development of many cellular and adaptive processes in Bacillus subtilis. In this study, we also aimed to characterize the regulatory mechanisms acting on the bacilysin biosynthetic operon. Thus, we first localized the promoter region of bac operon by 5'-RACE-PCR analysis and it was found that bac operon transcription is controlled from a A-type promoter. Furthermore, inspection of the sequence around the bac transcriptional start site revealed out putative Spo0A, AbrB and CodY binding motifs. Subsequently, we performed electrophoretic mobility shift assays to checked wheather the bac operon is directly regulated by the global transcriptional regulatory proteins Spo0A,ComA, CodY and AbrB and also to test whether they can bind to bac promoter simultaneously or compete for binding. These studies indicated that expression of bac operon is under the direct control of Spo0A,ComA, CodY and AbrB regulatory proteins: positive regulators Spo0A and ComA compete for binding to bac promoter and they are capable of displacing each other from bac promoter in a concentration-dependent manner while negative regulators AbrB and CodY can bind smiultaneously to bac promoter.
Özet (Çeviri)
Bacillus subtilis, ticari öneme sahip birçok ikincil metabolit üretebilen Gram pozitif bir bakteridir. Bu önemli bakteri özellikle toprak, bitki kökleri veya hayvanların gasterointestinal sistemi gibi karasal ve sulak ortamlarda yaşabilmektedir. Birçok Bacillus türünde olduğu gibi Bacillus subtilis de mezofilik bir mikroorganizmadır ve bir gün içerisinde 37oC'de normal boyutlarda bir koloni oluşturabilmektedir. Ürettiği ikincil ürünler arasında, vitaminler, çeşitli enzimler ve antimikrobiyal özelliklere sahip metabolitler sayılabilir. Besin kıtlığı ya da çevresel stresler gibi durumlarda Bacillus subtilis hücreleri hayatlarını sürdürmek için birçok farklı uyum yolları geliştirirler. Bacillus subtilis yüksek adaptasyon kabiliyeti sayesinde, zorlu yaşam koşullarına uyum gösterebilmektedir. Eğer çevresel koşullar, hızlı büyüme evresinin sonlarında, optimum büyüme şartlarında aşağı doğru saparsa Bacillus subtilis bu kısıtlı çevresl durumdan kaçabilmek adına, motilite (hareketlilik) kazandıracak kimyasala yönelme (kemotaksis) özelliğini geliştirmektedir. Eğer durağan büyüme evresinde hala besinsel kıstıtlılık devam ediyorsa, bu hücreler, proteazlar gibi çevredeki alternatif gıda kaynaklarını parçalayabileceği enzimler ve/veya kendisini bulunduğu ortamda üstün kılabilecek antibiyotikler üretmekte ve dış ortama salmaktadır. Daha ileriki aşamalarda, Bacillus subtilis dışarda bulunması muhtemel DNA parçalrını hücre içine almak için kompetens geliştirmekte ve genetik çeşitliliğini arttırmaya çalışmaktadır. En son durak olarak, tüm bu adaptif cevapların yetersiz kaldığı devam eden besinsel kıtlık durumlarında spor oluşturmaktadır. Sporlanma adaptasyonda gelinebilecek son duraktır, bakterinin ortam koşulları düzelene kadar hayati fonksiyonlarını askıya alması olarak tanımlanabilir. Tüm bu adaptif cevaplar, hücre yoğunluğunun algılanması ile oluşan sinyalizasyon ağı (quorum sensing signalling network) tarafından düzenlenmektedir. B. subtilis'de, iki peptid feromonu ComX ve CSF (Kompetans ve Sporlanma Faktörü) eksponansiyel büyüme sırasında hücre dışında birikerek, kompetens gelişimi başta olmak üzere diğer hücresel proseslerle ilgili olan pek çok genin ekspresyonunu sağlamaktadırlar. Hücre yoğunluğuna göre sporlanmanın indüklenmesi ise çok daha karışık bir süreç olarak ortaya çıkarılmıştır. Bacillus subtilis 168 tarafından üretilen dipeptid antibiyotik basilisin, oldukça basit yapılı peptid antibiyotik olup N-terminal L-alanin ve C-terminal epoksi amino asit antikapsinden ibarettir. Modifiye bir amino asit olan antikapsin biyosentezinin aromatik amino asitlerin genel biyosentetik yolunda şikimik asitten sonraki bir reaksiyon adımından dallandığı gösterilmiştir. Çok geniş bir spektrumda bakteri ve mantar üzerine etkilidir. Basilisinin anti-mikrobiyel etkisi antikapsin yapısından ileri gelmektedir. Basilisin hücre içine oligopeptid permeazlar ile alınır. Bunu takiben hücre içi proteazlar, basilisini L-alanin ve L-antikapsine parçalarlar. Hücre içindeki L-antikapsin glukozamin sentazlara bağlanarak hücre duvarı sentezini engellemektedir. Hücre duvarı oluşturamayan hücre sonuçta lize olarak ölmektedir. Polisistronik bir operon olan bacABCDEF (önceleri ywfBCDEFG) ve monosistronik bir gen olan ywfH Bacillus subtilis'te basilisin biyosentezinden sorumludurlar. BacA, BacB, YwfG ve YwfH antikapsin üretiminde rol alırlarken, BacD L-alanin ve L-antikapsinin ligasyonundan sorumludur. bacE gen ürünü basilisine karşı organizmanın kendi direncinin oluşmasını sağlamaktadır. Basilisin biyosentezi, lipopeptid antibiyotik sürfaktin biyosentetik operonunda olduğu gibi ComQ/ComX, PhrC (CSF), ComP/ComA' nın etkisinde hücre yoğunluğu sinyali (quorum sensing) mekanizmasının kontrolü altındadır ve bu biyosentez Spo0K (Opp)' ye bağlı bir biçimde gerçekleşmektedir. Bacillus subtilis'de basilisin üretimi comP, comA, comQ, spo0H, oppA, phrK, phrF ve phrC genleri tarafından kodlanan hücre yoğunluğu sinyali düzenleyici proteinleri tarafından transkripsiyonel seviyede pozitif yönlü olarak düzenlenmektedir. Sporlanma genlerinden spo0A faktörünün bloke edildiği mutantlarda basilisin üretiminin kaybolması, aynı zamanda abrB geni bozulmuş mutantlarda basilisin üretiminin artması ve ayrıca spo0A faktörü ile birlikte abrB geninin bloke edildiği ikili mutantlarda basilisin–negatif fenotipin ortadan kalkması, basilisin üretiminde görev alan bazı genlerin transkripsiyonlarının abrB gen ürününün negatif kontrolü altında olduğunu ve Spo0A proteini ile desteklendiğini ortaya çıkarmıştır. Bunun yanısıra, AbrB, CodY ve ScoC basilisin üretimini negatif yönlü olarak düzenlenmektedirler. Ayrıca yeni bir gen tarafından kodalanan GntR tip ailesi düzenleyici protein olan YvfI da basilisin biyosentezi için esansiyeldir. Son yıllarda yapılan çalışmalar göstermektedir ki, Bacillus hücreleri tarafından üretilen antibiyotikler, adaptif savunma mekanizmasındaki önemli rollerinin yanı sıra hücre yoğunluğu algılanması sinyalizasyonu çerçevesinde, hücrenin adaptif cevaplarının oluşturulmasına önemli katkı sağlamaktadır. Bu çalışmada, basilisinin üretildiği organizmadaki fonksiyonel rolünün aydınlatılması üzerine odaklanılmıştır. Bunun için, doğal olarak basilsin üreten kontrol suşu PY79 ve onun basilisin üretemeyen türevi olan OGU1 (bacA::lacZ::erm) suşu arasında, logaritmik faz (~OD600 0,7) ve durağan faz esnasında (~OD600 7) genom bazında karşılaştırmalı transkriptom analizi gerçekleştirilmiştir. Mikroarray yöntemi ile elde edilen ve daha önce değerlendirilen verileri doğrulamak için logaritmik ve durağan fazlar sırasında baskılandığı ya da indüklendiği gösterilen genlerin kantitatif analizleri ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, basilisin tarafından etkilenen genlerin; kompetens geliştirilmesi, biofilm oluşumu ve sporlanma, membran biyoenerjetiği (koenzim ve prostetik grup biyosentezleri), transport mekanizmaları, atipik koşullara uyum, detoksifikasyon ve karbonhidrat, azot, lipid ve sülfür metabolizmaları gibi intermediyer metabolizmalar gibi birçok hücresel prosesin oluşumunda görev aldığı bulunmuştur. Böylece, tüm bu sonuçlar neticesinde, basilisinin Bacillus subtilis'de birçok fizyolojik ve adaptif olayların gelişiminde düzenlenyici rol aldığı kuvvetle öne sürülebilmektedir.
Benzer Tezler
- Improvement of Bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilisPY79 VIA CRISPR/CAS9 technology
Bacillus subtilis PY79 suşunda basilisin biyosentezinin CRISPR/CAS9 teknolojisi ile iyileştirilmesi
HADEEL WALEED ABDULMALEK
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Bacillus subtilis GntR ailesine ait LutR transkripsiyon faktörünün doğrudan kontrolü altındaki genlerin CHIP ve EMSA yöntemleriyle belirlenmesi
Determination of genes under the direct control of GntR-type transcriptional factor LutR in Bacillus subtilis PY79 by CHIP and EMSA methods
MURAT KEMAL AVCI
Doktora
Türkçe
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Detection of YvfI-SinR co-regulated genes and the effect of DegU transcriptional factor on the expression of YvfI gene in Bacillus subtilis
YvfI-SinR proteinleri tarafından birlikte düzenledikleri genlerin belirlenmesi ve Deg-U transkripsiyon faktörünün Bacillus subtilis' deki YvfI gen ekspresyonuna etkisi
BÜŞRA ÖZTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
- The effect of blue light on unicellular organisms at transcriptome level
Mavi ışığın tek hücreli organizmaların transkriptom profiline etkisi
MEHMET TARDU
Doktora
İngilizce
2016
BiyolojiKoç ÜniversitesiHesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM HALİL KAVAKLI
- Blue light dependent expression of vibrio cholerae photolyase
Vibrio cholerae fotoliaz enzimi ifadesinin mavi ışığa göre değişimi
ONUR ÖZTAŞ