Improvement of Bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilisPY79 VIA CRISPR/CAS9 technology
Bacillus subtilis PY79 suşunda basilisin biyosentezinin CRISPR/CAS9 teknolojisi ile iyileştirilmesi
- Tez No: 874315
- Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 126
Özet
Gram-pozitif bir toprak bakterisi olan Bacillus subtilis; tarım, tıp ve farmakoloji gibi çeşitli alanlarda çalışan biliminsanları ve araştırmacıların büyük ilgisini çekmektedir. Hücre yoğunluğuna bağlı biyofilm ve dirençli endosporlar oluşturarak besin eksikliğine ve kötü şartlara dayanabilmesini sağlayan, yüksek adaptasyona sahip metabolik sistemi sayesinde, özellikle hücre farklılaşma çalışmaları için, üstün bir model organizma olarak kabul görmektedir. Ek olarak, B. subtilis bitki, hayvan ve insan sağlığına katkıda bulunan önemli bir probiyotik bakteri olarakda oldukça değer görmektedir. B. subtilis'in tam genom analiz sonuçları, onun düşük G+C yüzdesine sahip olmasının yanı sıra, 4000'den fazla fonksiyonel protein kodlama genine sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır. Çubuk şekline sahip, oksijenli ve oksijensiz ortamda büyüyebilen bir bakteri olan B. subtilis, aynı zamanda pekçok değerli proteinleri, enzimleri ve antimikrobiyal aktiviteye sahip pek çok ikincil metabolitleri üretip dışarıya salabilmektedir. Tüm bu özellikler, B. subtilis bakterisini, genetik mühendislik ve biyoteknoloji alanında yaygın olarak kullanılan çekici bir bakteriyel araç yapmıştır. Basilisin, ribozom dışı sentezlenen, L-alanin ve protein dışı bir aminoasit olan L-antikapsinden oluşan ikili peptit yapıda bir antibiyotiktir. B. subtilis başta olmak üzere, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis ve Bacillus velenzensis gibi pek çok farklı Bacillus türleri tarafından üretilmektedir. Küçük yapısına rağmen, bakterilerden küflere kadar etki edebilen çok geniş spektrumlu bir antibiyotik olması ile dikkat çekmektedir. Basilisin, antimikrobiyal etkisini yapısında bulunan antikapsine borçludur. Basilisin hücre içine taşındığında, peptidazlar tarafından kesilerek açığa çıkan antikapsin, glukozamin-6-fosfat sentetaz enzimini inhibe etmektedir. Bu nedenle, basilisin, küflerde mannoprotein yapılı hücre duvarı sentezini, bakterilerde ise petidoglikan hücre duvarı sentezinin durdurarak hücrelerin ölümüne neden olmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar basilisinin elma, armut, ayva vb. pek çok bahçe ağacında ateş yanığı hastalığına neden olan Erwinia amylovora bakterisine ve pirinç bitkisinde hastalığa neden olan Xanthomonas türlerine karşı etkili olduğunu göstermiştir. Ek olarak, patojen alg türlerine karşıda antimikrobiyal etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Basilisin aynı zamanda yüksek sıcaklıkta ve çok geniş pH değişiminde aktivitesini koruyabilen oldukça dayanıklı bir yapıya sahipdir. Tüm bu özellikler, basilisini, ilaçdan, gıdaya ve tarıma çok farklı sektördeki uygulamalar için oldukça cazip, potansiyel bir aday yapmaktadır. Ancak, B. subtilis gibi doğal üretici organizmalarda, basilisin üretim seviyelerinin çok düşük olması, endüstriyel uygulamada yaygın kullanımını oldukça kısıtlamaktadır. Bu nedenle, bu tez çalışmasında basilisinin doğal üreticisi, B. subtilis PY79 suşunda basilisin üretim seviyesinin iyileştirilmesi amaçlanmıştır. Bakterilerde, translasyon başlangıç hızı, gen ifade düzeyini belirleyen, en önemli sınırlayıcı etkendir. Translasyonun başlatılması, bir mRNA'nın 5′ UTR bölgesi içinde yer alan ribozom bağlanma bölgesinde (RBS) meydana gelir. Bakterilerde, RBS bölgesi,“Shine-Dalgarno”(SD) dizisi olarak adlandırılan bilinen korunmuş bir DNA dizisi, başlangıç kodonu ve ikisi arasında kalan kısa bir uzantı dizisinden oluşur. SD dizisi, 30S ribozomal alt biriminde bulunan 16S rRNA'daki anti-SD dizisi arasında temel baz eşleşmesi yoluyla, 30S ribozomal alt biriminin başlangıç kodununu içine alacak şekilde mRNA 5'UTR bölgesine yeleştirilmesini sağlamaktadır. Bu nedenle translasyon başlangıcında anahtar rol oynar. SD dizisinin etkinliği, hem 16S rRNA'nın anti-SD dizisiyle olan baz eşleşme potansiyeline hemde başlangıç kodonuna olan uzaklığına bağlıdır. Çoğu bakteri için kanonik SD dizisi, 16S rRNA'nın anti-SD dizisiyle en uyumlu olan“UAAGGAGG”dizisidir. Yapılan çalışmalarda, SD-anti-SD etkileşiminin artırılması ile gen ifade düzeyinin yükiseltildiği ve böylece protein üretiminin iyileştirildiği gösterilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, SD dizisi ve başlangıç kodonu arasındaki mesafe, translasyon başlangıç hızını etkilmektedir. Eğer mesafe çok yakın veya çok uzak ise, başlangıç verimliliği azalmaktadır. Bakteriyel genomlarda, SD dizisi ve başlangıç kodonu arasındaki mesafe aralığı genellikle 5 nt ila 13 nt arasında değişmektedir. Ancak 8 nt ila 10 nt aralığındaki mesafenin E. coli genleri için ideal olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde, pek çok B. subtilis geni içinde kanonik SD dizisi ile AUG başlangıç kodonu arasındaki ideal mesafe 7-9 nt olarak bulunmuştur. B. subtilis 168'de, bacABCDEF operonu ve bacG geni, anticapsin ve basilisin sentezinden sorumlu enzimleri kodlamaktadır. bacABCDEF operonunun ilk geni olan bacA transkripsiyon başlangıç bölgesi incelendiğinde, B. subtilis sigma faktörü σA için güçlü bir promotor dizisi bulunurken, translasyon başlatma kodonu AUG'yi çevreleyen, belirgin güçlü bir SD-dizisinin bulunmadığı görülmüştür. Bu eksiklik, RBS bölgesinin iyileştirilmesi ile basilisin üretiminin artırılabileceğine kuvvetle işaret etmiştir. Bu öngörü ile, bu çalışmada, CRISPR/Cas9 tek plazmid sistemi (pJOE9958.1) kullanılarak, bacA'nın varsayılan RBS bölgesinin, bacA AUG başlangıç kodonuna mesafesi 8 nt olacak şekilde dizayn edilmiş kanonik SD dizisi“TAAGGAGG”içeren“GCTTAAGGAGGACAAACTC-3”(bacA.güçlüRBS) dizisi ile yer değiştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla öncelikle, "bacA.güçlüRBS dizisini içeren 932 bç DNA homoloji şablonu, eşlenik uzatma PZR (overlap extension PCR) yaklaşımı ile oluşturulmuş ve pJOE9958'nin SfiI kesim bölgesine klonlanmıştır. CCTop yazılımı kullanılarak, -28 ve -8 pozisyonlarında bacA başlangıç kodonuna göre -28 nt ve -8 nt pozisyonunda yer alan 20 nt lik bölge, klavuz RNA (gRNA) dizisi olarak seçilmiştir. İki ucunda BsaI kesimi dizisi olacak şekilde çift DNA dizisi olarak sentezlettirilen klavuz RNA dizisi, pJOE9958'in BsaI kesim bölgesine klonlanmıştır. Oluşturulan plazmit pJOE9958.1.bacAgüçlüRBS.sgRNA olarak adlandırılmış ve hedef değişikliğin gerçekleştirilmesi için, B. subtilis hücrelerine aktarılmıştır. İlgili transformantlar, 30°C sıcaklıkda, Km ve % 0.2 mannoz içeren LB agar plakalar üzerinde seçilmiştir. İki günun sonunda ortaya çıkan 21 koloni toplanarak, Km içeren LB plakalara aktarılmış ve 30oC sıcaklıkda bir gece inkübe edilmiştir. Plazmid giderimi işleminden önce, olası homolog olmayan uç birleştirme (non-homologous end joining) (NHEJ) onarımı nedeni ile basilisin üretim kabiliyetini yitiren kolonilerin elenmesi için, seçilen Km dirençli koloniler, basilisin üretme kabiliyeti yönünden disk difüzyon testi ile taranmıştır. Sadece üç koloni, test organizma olarak kullanılan S. aureus'a karşı antibakteriyel aktivite göstermiştir. Bu sonuç, bizim çalışmamızda, Cas9 kaynaklı DNA çift zincir kırığının (DSB'ler) onarılması için, homoloji-yönlendirilmiş onarım (homology-directed repair) (HDR) yolu verimliliğinin düşük kaldığı, çalışmamızdaki kolonilerin çoğunun muhtemelen NHEJ yolundan kaynaklandığına işaret etmiştir. Km dayanıklı ve basilisin üretebilen üç koloni ile plazmid giderimi basamağına devam edilmiştir. Bunun için, koloniler Km içermeyen LB plakalara taşınmış ve gece boyunca 50oC'de inkübe edilmiştir. Ertesi gün, Km içermeyen LB plaklara tek koloni düşecek şekilde ekim yapılarak, 42°C'de tekrar bir gece inkübe edilmiştir. Test edilen koloniler içinde yaklaşık % 42'sinin pJOE9958.1.bacAgüçlüRBS.sgRNA plazmidini kaybettiği tespit edilmiştir. Akabinde, rastgele seçilen onbir adet Km-duyarlı plazmidi giderilmiş koloni, bacA.güçlüRBS dizisi varlığı açısından, koloni PZR yöntemi ile taranmıştır. Yapılan taramada yaklaşık on kolonide, 440 bp'lik beklenen PZR ürünü elde edilmiştir. PZR-pozitif koloniler arsından rastgele bir tanesi seçilerek DNA dizileme analizine gönderilmiştir. Yapılan DNA dizi analizi, bacAgüçlüRBS dizisinin bacAdoğalRBS dizisi ile değiştirildiğini doğrulamıştır. Güçlü RBS değişiminim etkisinin değerlendirilmesi için, sekans analizi ile doğrulanmış güçlü-RBS mutantı ile birlikte rastgele seçilmiş yedi mutant (PZR-pozitif kolonilerden) 16-18 saat boyunca PA ortamında kültive edilmiş ve kültür sıvılarında bulunan basilisin seviyesi disk difüzyon testi ile belirlenmiştir. PY79 ile karşılaştırıldığında, incelenen mutantların her birinin yüksek düzeyde basilisin ürettiği ve kendi aralarında artan basilisin seviyelerinde önemli bir farklılık olmadığı görülmüştür. Bu sonuç, güçlü RBS değişiminin basilisin üretiminin artırılmasına yol açtığını göstermiştir. Test edilen bu mutantlar arasından, bacAgüçlüRBS değişimini temsil etmek üzere rastgele bir mutant seçilmiş ve daha ileri analizlerde kullanılmak üzere B. subtilis HWA olarak adlandırılarak -80oC de stoklanmıştır. Bir ileri analiz olarak, HWA ve PY79, 24 saat boyunca 37°C'de PA besi yerinde çalkalamalı olarak kültive edilmiş, ve belirli aralıklarla örnekler alınarak, büyüme profilleri ve basilisin üretim düzeyleri takip edilmiştir. PY79 suşuna kıyasla, HWA'da hem büyüme hemde basilisin birikim profillerinde bir değişiklik bulunmamıştır. Her ikiside en yüksek basilisin aktivitesini, 16-18 saatlik kültivasyon sürecine denk gelen durgunluk aşamasının erken aşamasında ulaşmaktadır. Ancak, en dikkat çekici bulgu, HWA'nın tüm büyüme aşamalarında, basilisin düzeyinin PY79 suşuna kıyasla hep yüksek seyretmesidir. Her ikisinin maksimum seviyede seyrettiği 18 saatlik kültür sıvılarındaki basilisin düzeyleri karşılaştırıldığında, HWA suşundaki basilisin miktarının, 2.87 kat daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Bu önemli artış, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile de doğrulanmıştır. UPLC-MS analizinde, HWA suşunun 16-18 saatlik PA kültür ekstresi, PY79 ile karşılaştırıldığında, basilisinin kütlesine karşılık gelen m/z 271 (M + H)+ pik düzeyi çok daha yüksek bir oranda bulunmuştur. Bakterilerde, transkripsiyon ve translasyon basamakları birbirleri ile içiçe olduğu olduğu için, 5' UTR yapılan bir değişiklik hem transkripsiyon hemde translayon düzeyini etkileyebilir. Bu nedenle, çalışmamızda gerşekleştirilen güçlü RBS değişiminin bac operon transkripsiyon düzeyine olası etkisi, Ters Transkriptaz- Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-qPZR) ile araştırılmıştır. Bu analiz için, büyümenin erken ve geç durağan fazına denk gelen 18 saatlik ve 24 saatlik HWA ve PY79 RNA örnekleri kullanılmıştır. HWA suşunda, bac operon-mRNA seviyesi, PY79 suşuna kıyasla, erken durağan fazda 3 kat daha yüksek bulunmuştur. Ayrıca, geç durağan fazda PY79 suşunda tespit edilen 29 kantitatif döngünün (Cq) aksine, HWA suşunda bac operon-mRNA seviyesinin, erken durağan fazda 25 ve geç durağan fazda 21 kantitatif döngü olarak tespit edilmesi, HWA daki bac operon-yüksek mRNA seviyesinin durağan faz boyunca korunduğunu göstermiştir. Tüm bu sonuçlar, güçlü RBS değişiminin bac operon-mRNA stabilitesini artırdığına işaret etmiştir. Özet olarak, bu çalışmada, basilisin üretim düzeyinin iyileştirilmesi amacı ile, basilisin biyosentezinden sorumlu bac operonunun RBS bölgesinin iyileştirilmesi için CRISPR/Cas9 tek-plasmid sistemi kullanılarak, standart SD dizisinin (TAAGGAGG) bacA başlangıç kodununa (AUG) 8 nt'lik en uygun mesafe ile yerleşimi gerçekleştirilmiştir. Beklenildiği gibi, güçlü RBS değişimi, basilisin üretim düzeyinde önemli bir artış ile sonuçlanmıştır. Ayrıca, bac operonunun transkripsiyon seviyesinin özellikle geç durağan fazda PY79 suşuna kıyasla yüksek düzeyde korunduğu görülmüştür. Elde edilen bu veriler, güçlü bir RBS değişiminin, hem translasyon verimliliğini hemde mRNA stabiletesini iyileştirdiğini göstermiştir. Sonuç olarak, bu çalışma geniş kapsamlı bir RBS mühendisliğinin, doğal üretici suşlarda basilisin üretimini artırmak için uygulanabilcek umut verici bir yaklaşım olabileceğinide ortaya çıkarmıştır.
Özet (Çeviri)
Bacillus subtilis, a common Gram-Positive soil bacterium, has received significant attention from scientists and researchers in various fields such as agriculture, industry, medicine, and pharmacology. It is widely regarded as an excellent host model due to its highly adaptable metabolic system, which allows it to withstand nutrient scarcity by forming highly resistant endospores. Furthermore, B. subtilis is capable of producing biofilms in response to cell density. From an environmental perspective, B. subtilis is a crucial probiotic bacterium that helps plant, animal, and human health. Whole genome analysis reveals its low G+C content and over 4000 functional protein-coding genes, making it an attractive genetic tool extensively utilized in genetic engineering and biotechnology. Moreover, this rod-shaped aerobic (facultatively anaerobic) prokaryote exhibits a remarkable secretion capacity for a wide range of valuable proteins, enzymes, and significant secondary metabolites with antimicrobial properties. Bacilysin, also known as bacillin or tetaine, is a non-ribosomal synthesized dipeptide antibiotic made up of two amino acids: The N-terminal L-alanine and the C-terminal non-proteinogenic amino acid L-anticapsin. It is produced by various species of Bacillus, including Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, and Bacillus velenzensis. Despite its simple structure, bacilysin has a wide range of antimicrobial activity against bacteria and fungi. The antimicrobial activity of bacilysin is due to its anticapsin component, which is released when it is transported into the cell and undergoes proteolysis. This anticapsin then inhibits glucosamine-6-phosphate synthase, preventing the biosynthesis of mannoprotein in fungi and peptidoglycan in bacteria. As a result, the microbial cells undergo lysis. Recently, bacilysin was found to be effective in controlling fire blight disease in orchard trees and rice diseases caused by Xanthomonas sp. It also exhibited anticyanobacterial activity against harmful algal species. Bacilysin is highly heat-stable and remains active over a wide pH. These characteristics make it a promising candidate for various industries, including pharmaceuticals, food, and agriculture. However, the low production by the native producer hinders its use in industrial applications. Therefore, in this thesis study, we aimed to improve the bacilysin biosynthesis in its native producer, B. subtilis PY79. In bacteria, translation initiation is often the rate-limiting step of translation and a major factor in determining gene expression levels. Translation initiation occurs at the ribosome binding site (RBS) within the 5′ untranslated region (5′UTR) of an mRNA. In bacteria, the RBS contains the Shine Dalgarno (SD) sequence, the start codon, and a short spacer sequence. The SD sequence plays a crucial role in translation initiation by recruiting the 30S ribosomal subunit to the start codon through base-pairing with the anti-SD sequence in the 16S rRNA. The effectiveness of the SD sequence depends on its base pairing potential and its spacing from the start codon. The canonical SD sequence for most bacteria is UAAGGAGG, which complements well with the anti-SD sequence of 16S rRNA. Studies have shown that increasing the SD-anti-SD interaction improves protein production and overall translation levels. The spacing between the SD sequence and start codon also affects translation initiation efficiency. If the spacing is too close or too far, initiation levels decrease. In bacterial genomes, the spacing of the SD sequence generally varies from 5 to 13 nt, with 8 to 10 nt being ideal for E. coli genes. Similarly, the ideal spacing between the canonical SD sequence and the AUG start codon is 7-9 nt for various B. subtilis genes. In B. subtilis 168, the bacABCDEF operon and the monocistronic gene bacG encode enzymes responsible for the synthesis of anticapsin and bacilysin. The sequence around the bacA transcriptional start site shows a strong consensus signature for the B. subtilis sigma factor σA, but there is no obvious strong SD-like sequence surrounding the translation start codon AUG. This suggests that improving the RBS region could enhance bacilysin production. Therefore, in this study, by using a CRISPR/cas9 single plasmid system (pJOE9958.1), the putative RBS region of bacA, as the first gene of the bacilysin biosynthetic operon, was edited by introducing the conanical SD sequence (TAAGGAGG) at 8 nt optimum spacing from the bacA translation start codon (AUG). To achieve this, a 932 bp homology template was initially generated through overlapped-extension PCR. This template contained a strong ribosomal binding site (5'-GCTTAAGGAGGACAAACTC-3') (bacAstrongRBS), which was then cloned into the SfiI cutting site of pJOE9958. A 20 nt spacer sequence from the upstream region was selected, specifically at positions -28 and -8 relative to the bacA start codon, by using the software CCTop. This sequence was synthesized into two complementary oligonucleotides and inserted it between the BsaI sites of pJOE9958. The resulting plasmid was named pJOE9958.1.bacAstrongRBS.sgRNA, and it was used for the transformation of B. subtilis PY79-competent cells. Transformants were selected on LB agar plates with Km and 0.2% mannose at 30oC to induce cas9 expression. Within two days, 21 colonies appeared, and they were streaked again on LB plates with Km and incubated at 30oC. Before the plasmid curing step, colonies resistant to Km were tested for their ability to produce bacilysin, eliminating any mutants that were unable to do so. Only three colonies exhibited antibacterial activity against S. aureus, indicating that the efficiency of homology-directed repair (HDR) was insufficient to repair Cas9-induced double-strand breaks (DSBs), and most of the colonies in our study likely arose from the NHEJ pathway. Subsequently, only colonies resistant to Km and capable of producing bacilysin were plated on LB plates without Km and incubated at 50oC overnight, which prevents plasmid replication. They were then restreaked on LB plates at 42oC to generate plasmid-cured cells, and approximately 42% of the examined colonies were found to be plasmid-cured. In the final step, 11 randomly selected Km-sensitive (plasmid-cured) transformants were screened with colony PCR to identify mutants with the substitution of the bacAstrongRBS sequence with the bacAnativeRBS sequence. Out of the 11 transformants, 10 displayed the expected PCR fragment of approximately 440 bp. DNA sequencing of one randomly chosen PCR-positive colony confirmed the successful replacement of the bacAnativeRBS sequence with the bacAnativeRBS. To assess the impact of the strong RBS insertion, eight mutants, including the strong RBS mutant confirmed by sequence analysis and the seven randomly selected mutants (from the PCR-positive colonies), were cultured in PA media for 16-18 hours. The level of bacilysin in their culture fluids was then determined using a paper disk-diffusion assay. Compared to the PY79 strain, each of the examined mutants produced more bacilysin, and there were no significant differences in their increased bacilysin levels. These results demonstrated that the strong RBS substitution led to enhanced bacilysin production. Finally, one of the mutants with the bacAstrongRBS sequence was chosen to represent the strong RBS-carrying mutants and designated as B. subtilis HWA for further investigation. To further investigate the impact of the strong RBS substitution on bacilysin overproduction, HWA and the parental strain PY79 were grown in PA medium at 37°C with shaking for 24 hours, and their growth and bacilysin production levels were monitored at regular intervals. no significant differences in the growth patterns or the accumulation of bacilysin in HWA compared to PY79. In both strains, the highest bacilysin activity was detected during the early stage of the stationary phase, which occurred around 16-18 hours of cultivation. However, the most notable finding was that HWA consistently exhibited overproduction of bacilysin at all growth stages, with the peak occurring at 18 hours of incubation. The bacilysin titer in HWA was 2.87 times higher than that of the wild-type strain. This significant increase in bacilysin activity was further confirmed by UPLC-MS analysis, which revealed a higher relative abundance of the peak m/z of 271 (M + H)+, corresponding to the mass of bacilysin, in HWA compared to PY79 during the 16-18 hours culture period. In bacteria, the processes of transcription and translation are closely linked. Modifying the nucleotides in the 5' untranslated region (5'UTR) can have an impact on both transcription and translation. Therefore, to demonstrate the effect of modifying the 5'UTR through a strong ribosome binding site (RBS) substitution on intracellular mRNA levels, the relative amounts of transcripts from the bac operon were examined in two bacterial strains, HWA and PY79, by using the RT-qPCR technique. These measurements were performed during the early and late stationary phases of growth, which correspond to 18 hours and 24 hours of growth, respectively. In HWA, the mRNA levels of the bac operon showed a significant change. Specifically, during the early stationary phase, the transcript levels were three times higher compared to PY79. Additionally, the transcript level in HWA was detected at 25 quantitative cycles (Cq) during the early stationary phase (18 hours) and 21 Cq during the late stationary phase (24 hours). In contrast, PY79 exhibited a Cq value of 29 at 24 hours. These findings indicated that the high transcript level of the bac operon in HWA is maintained throughout the stationary phase. In conclusion, these results provide evidence that the strong RBS substitution also improves the stability of the bac operon mRNA. In summary, in this study, a CRISPR/Cas9 single-plasmid system was used to edit the putative RBS region of the bac operon. The canonical SD sequence (TAAGGAGG) at an optimal spacing of 8 nt from the bacA start codon (AUG) was introduced. Because the upstream region of the bac operon did not have an ideal core SD sequence with a spacing of 7-9 nt. Therefore, editing the bacA-RBS most likely has a positive impact on bacilysin production in its native producer. As expected, modifying the 5'UTR through strong RBS substitution led to a significant increase in bacilysin production. Additionally, the transcript level of the bac operon was significantly increased, especially in the late stationary phase. This suggests that a strong RBS substitution in the bac operon can improve translation initiation efficiency and mRNA stability. Overall, these findings indicate that extensive RBS engineering could be a promising approach to enhancing bacilysin production in native producers. This study is the first to employ RBS editing to improve bacilysin production in B. subtilis PY79, and our results will contribute to further enhancing bacilysin production in native strains.
Benzer Tezler
- İnsan kaynakları yönetimi uygulamalarının örgütsel performansa etkisi
The impact of human resources management practices on organizational performance
BELKIS KUZUTÜRK
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
İşletmeBaşkent ÜniversitesiYönetim Bilişim Sistemleri Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ERDEM KIRKBEŞOĞLU
- Türkiye'de radyo ve televizyon yayıncılğı, yasal süreçte yaşanan sorunlar ve çözüm önerilei
Radio and television broadcasting in Turkey,the problems and offers for solutions on the way of legal duration
NURETTİN BAY
Yüksek Lisans
Türkçe
2006
İletişim BilimleriSelçuk ÜniversitesiRadyo Televizyon Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. AYTEKİN CAN
- Sarmısak ekiminde kullanılacak pnömatik ekim düzeninin geliştirilmesi
Improvement of a spacing drill pneumatic system in garlic sowing
H. GÜRAN ÜNAL
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
ZiraatAnkara ÜniversitesiTarım Makineleri Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BAHRİ GÖKÇEBAY
- Al-alaşımlarında yaşlandırma sertleşmesiyle aşınma dayanımının iyileştirilmesi
Improvement of resistance to corrosion with ageing hardness in aluminium alloys
ÜMİT GÜRKAN BİRİCİK
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Makine MühendisliğiUludağ ÜniversitesiMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. A. HALİM DEMİRCİ
- Salçalık domateslerin protoplast kültür teknikleri ile iyileştirilmesi
Improvement of tomato plant for paste via protoplast culture techniques
AYCAN YOLVER