İnsan URG-4 (Up-Regulated Gene 4) geninin transkripsiyonel regülasyonu
Transcriptional regulation of human URG-4 (Up Regulated Gene 4) gene
- Tez No: 373233
- Danışmanlar: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 213
Özet
Up-regulated gene 4 (URG-4) geni, ilk olarak HBxAG proteinin doğal regülatörü olarak bulunmuştur. Sitokinlerle regülasyonu ve transkripsiyonel aktivitesi ile ilgili literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. URG-4 geninin transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, yaklaşık 530 bç'lik (-482/+63) ve minumum transkripsiyonel aktivitenin belirlenmesi için, kısaltılarak yapılmış promotor parçalar (-109/+63, -261/+63, -344/+63) PCR'a dayalı GC zengin stratejiler uygulanarak çoğaltıldı ve pMetLuc lusiferaz haberci vektör içerisine klonlandı. 530 bç lik promotor bölgesi NCBI gen bankasına kayıt edildi. Promotor bölgesinin TATA kutusu içermediği ve % 80 GC zengin bir bölge olduğu belirlendi. Transkripsiyon faktörü (TF) bağlanma motifleri incelendiğinde özellikle SP1 gibi çok sayıda TF bağlanma bölgesi içerdiği tespit edilmiştir. Transkripsiyonel aktivite için, URG-4 promotor parçaları, kalsiyum fosfat tekniği ile insan Karaciğer Kanser Hücre hattına (Hep3B) geçiçi transfeksiyon metodu kullanılarak aktarıldı. -109/+63 promotor parçasının bazal aktivitesinin en yüksek olduğu bulundu. Ayrıca kotransfeksiyon çalışmaları, hSP1 ve hUSF transkripsiyon faktörlerinin URG-4 promotorunun transkripsiyonel aktivitesini arttırdığı tespit edildi. DNA-protein etkileşim (EMSA) deneyleri, SP1 TF'nün -121/-159 bölgesine bağlandığını göstermiştir ve spesifik yarışma ve antikor süpershift deneyleri SP1'in bağlanmasını doğrulanmıştır. RT- PCR deneyleri SP1 aşırı ifadesinin URG4 mRNA'sını arttırdığı da tespit edilmiştir. URG-4 geni ve sitokinlerle ilişkisini aydınlatmak için, TGF-β ve TNF-α seçildi. Sitokinlerin etkisi hem mRNA hem de protein seviyesinde gösterildi. TGF-β sitokinin erken saatlerde URG-4 geninin ekspresyonunu mRNA ve protein seviyesinde arttırdığı ve TNF-α sitokininin ise 200Ü/mL doz uygulandığında arttırıcı etkisi olduğu görüldü. Aynı arttırıcı etki hepatoma olmayan yan model olarak seçilen prostat kanseri (PC3) hücrelerinde de tespit edildi. Yolak çalışmaları sonucunda TGF-β sitokinin MAPK/ERK yolağı üzerinden URG-4 genini etkilediği, TNF-α sitokininin ise JNK yolağıyla bağlantılı olduğu bulundu. URG-4 Varyant-1 cDNA'sı pCDNA3.2 vektörüne PCR'a dayalı bir teknikle klonlandı. Boş ve URG-4 genini içeren pCDNA3.2 vektörleri geçici olarak Hep3B, kalıcı olarak da Saos-2 hücrelerine transfeksiyonu yapıldı. Genin ektopik ifadesi RT-PCR, qPCR ve western metodları ile doğrulandı. Ayrıca, MTT deneyi ile, genin aşırı ifadesinin hücre proliferasyonuna arttırdığı belirlendi. Koloni formasyon deneyleri sonucunda, hücrelerin koloni oluşturma yeteneğini arttırdığı tespit edildi.
Özet (Çeviri)
URG-4 gene was firstly found as a natural effector of HBxAG protein. There is no information about regulation by cytokines or promoter activity of URG-4 gene. To determine transcriptional activity of URG-4 gene, 530 bp (-482/+63) promotor site of URG-4 gene and truncated deletion constructs were amplified using PCR methods with GC-rich strategies. Then cloned into pMetLuc Lusiferase reporter vector. -482/+63 promoter construct of URG-4 gene was submitted to NCBI data bank. URG-4 promoter is TATAless promoter and contains 80% GC rich seqeunce. Transcription factor binding motifs analysis show the promoter contains many putative SP1 binding sites. For the basal promoter activity, URG-4 promoter constructs were transient transfected by Ca phosphate transfection methods into the Hep3B (Human Hepatoma) cells. -109/+63 URG-4 promotor construct showed the highest transcriptional activity. In addition, cotransfection analysis showed that hSP1 and hUSF upregulate URG-4 promoter constructs. DNA-protein interaction assay (EMSA) shows that SP1 transcription Factor is able to bind to URG-4 promoter sites, -121/-159. Spesific competition assays and antibody supershift assays confirmes the binding of SP1 in to the promoter. RT- PCR also indicates over expression of SP1 upregulates URG4 mRNA expression level in Hep3B cells. To elucidate the effect of cytokines on URG-4 gene expression, cancer related TGF-β and inflamation related TNF-α were chosen. The effects of cytokines on mRNA and protein levels of URG-4 gene were studied. Our results indicated that TGF-β cyctokine effected URG-4 gene and 200 U/mL dose TNF-α showed upregulation of URG-4 gene expression both mRNA and protein level. The same increasing effect was determined in another cell type model, PC-3, prostate cancer cells. According to Pathway inhibitory assay, it was found that TGF-β upregulates URG-4 gene through MAPK/ERK pathway and TNF-α effected by using JNK pathway. Full lenght of URG-4 Variant-1 cDNA was cloned by PCR based approach into pCDNA3.2 eucaryotic expression vector. Expression plasmid that contains URG-4 gene were transient transfected to Hep3B and stable transfected into Saos-2 cells URG-4 expression level was confirmed by using RT-PCR, qPCR and western method. In addition, MTT and colony Forming assays, it was determined that the ectopic expression of URG-4 gene induces proliferative effects of cells.
Benzer Tezler
- Yazılım tanımlı ağlarda makine öğrenme temelli saldırı tespit sistemi
Machine learning based intrusion detection system in software defined networks
BİROL EMEKLİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolSakarya ÜniversitesiBilişim Sistemleri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. İHSAN HAKAN SELVİ
- Birikim, kriz ve 'Mekansal çözüm': Tuzla tersaneler bölgesi ve Yalova tersaneler bölgesi örnekleri
Accumulation, crises and spatial fix: The case of Tuzla and Yalova shipyards regions
REFİYE NEVRA AKDEMİR
Doktora
Türkçe
2014
Şehircilik ve Bölge PlanlamaMimar Sinan Güzel Sanatlar ÜniversitesiŞehir ve Bölge Planlama Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT CEMAL YALÇINTAN
PROF. DR. ASUMAN TÜRKÜN
- Meme dokusu karsinomlarında 7-etoksiresorufin O-deetilaz enzim aktivitesi düzeyinin araştırılması
Başlık çevirisi yok
SELMA AYGÖRMEZ
Yüksek Lisans
Türkçe
1997
Eczacılık ve FarmakolojiAnkara ÜniversitesiFarmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜMTAZ İŞCAN
- İnsan gonadlarının intrauterin gelişiminin histolojik değerlendirilmesi
Histological evaluation of the intrauterin development of human gonads
MURAT TOSUN
Doktora
Türkçe
1998
MorfolojiSelçuk ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SELÇUK DUMAN