İnsan Paraoksonaz 1 (pon1) geninin klonlanması, Pichia pastoris'te ekspresyonu, Rekombinant enzimin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Human Paraoxonase 1 (pon1) gene cloning, expression in Pichia pastoris, purification and characterization of Recombinant enzyme
- Tez No: 376235
- Danışmanlar: PROF. DR. ESABİ BAŞARAN KURBANOĞLU, PROF. DR. ORHAN ERDOĞAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2014
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Genel Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 133
Özet
Bu çalışmada metanolle indüklenen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında Pichia pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak insan paraoksonaz1(PON1) enziminin ekstrasellüler üretimi hedeflenmiş, böylece mikroorganizmanın üreme ortamına salgıladığı protein, hücreyi parçalamaya gerek kalmadan ortamdan saflaştırılabilmiştir. Bu amaçla insan PON1 geni pPICZαA ekspresyon vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör P. pastoris X-33 genomuna entegre edilmiştir. Böylelikle ekstrasellüler PON1 enzimi güçlü AOX promotörünün kontrolü altında eksprese edilmiş, Saccharomyces cerevisiae alfa faktör sinyal sekansı aracılığıyla enzimin fermentasyon ortamına salgılanması sağlanmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat geliştirilen rekombinant hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerine inoküle edilmiş, gelişen hücreler santrifüjle ayrıldıktan sonra metanol içeren çalkalamalı erlenmayer üretim besiyerine transfer edilerek 96 saat geliştirilmiştir. PON1 üretimi için karbon kaynağı olarak sorbitol ve AOX promotörünün indükleyicisi olarak her 24 saatte bir metanol ilave edilmiştir. SDS-PAGE ve western blot analizi, rekombinant P. pastoris tarafından üretilen ekstrasellüler PON1 enziminin molekül kütlesinin 59,1 kDa olduğunu göstermiş, ProbondTM afinite kolonu ile saflaştırıldıktan sonra enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Bu çalışmada PON1 enzimi, ilk kez P. pastoris ekspresyon sisteminde eksprese edilmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, extracellular production of human paraoxonase 1 (PON1) enzyme under the control of AOX (alcohol oxidase) promoter inducing with methanol by using Pichia pastoris expression system was aimed. So, protein which is secreted to fermentation medium by microorganism was purificated without the need to cell lysis. For this purpose, human PON1 gene was cloned into an expression vector pPICZαA and the recombinant vector was integrated to P. pastoris X-33 genome. In this way, extracellular PON1 enzyme was expressed under the control of the strong AOX promoter and the secretion of the enzyme in the fermentation medium was achieved by means of Saccharomyces cerevisiae alpha factor signal sequence. The recombinant cells grown for 48-72 hours in solid medium were inoculated in glycerol containing precultivation medium. After being separated by centrifugation, cells were grown for 96 hours by transferring into the methanol containing shake flask production medium. In order to produce PON1, sorbitol as a carbon source and methanol as an inducer of AOX promoter were added to the medium in every 24 hours. SDS-PAGE and western blot analyses illustrated that the molecular mass of extracellular PON1 enzyme produced by the recombinant P. pastoris strain was 59,1 kDa and after the enzyme purification with ProbondTM affinity column, biochemical characterization was done. This was the first time PON1 is expressed in P. pastoris expression system.
Benzer Tezler
- Erken yaş koroner arter hastalığında plazminojen aktivatör inhibitör 1 geni (4G/5G) ve paraoksonaz 1 geni (L55M ve Q192R) polimorfizmlerinin rolü
The role of plasminogen activator inhibitor 1 gene (4G/5G) and paraoxonase 1 gene (L55M and Q192R) polymorphisms in premature coronary artery disease
DİDEM SAVAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
GenetikAnkara ÜniversitesiTemel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. F. AJLAN TÜKÜN
- Tip II diabetli hastalarda serum paraoksonaz düzeyleri ve (PON1) 192 polimorfizmi
Serum paraoxonase levels and (PON1) 192 polymorphism in type II diabetes mellitus patients
SANEM GÖKÇEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2004
Tıbbi Biyolojiİstanbul ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. MÜJGAN CENGİZ
- Paraksonaz enzimi kullanılarak transkripsiyonel aktivite belirlenmesinde yararlanılacak bir aday haberci sisteminin oluşturulması
Generating a candidate reporter system using paraoxonase enzyme for determination of transcriptional activity
CEYLAN TOPRAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyolojiBalıkesir ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. HATİCE YILDIRIM
- Effect of a diet rich in olive oil phenolics on age-related changes in mouse model of ageing and HPLC analysis of olive oil phenolics with electrochemical detector
Zeytinyağı fenoliklerince zengin diyetin yaşlanması hızlandırılmış fare modelinde yaşlanmaya bağlı değişiklikler üzerine etkisi ve zeytinyağındaki fenolik maddelerin elektrokimyasal dedektör ile HPLC analizi
BANU BAYRAM
Doktora
İngilizce
2011
Beslenme ve Diyetetikİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BERAAT ÖZÇELİK
PROF. DR. GERALD RİMBACH
- Paraoksonaz 1 enziminin yeni bir hidrofobik jel ile saflaştırılması
Purification of the paraoxonase 1 enzyme wi̇th a new hydrophobi̇c gel
EMRE YAVUZ