Geri Dön

DNA-based assembly of transcription factors for bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay

Biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) analizi için transkripsiyon faktörlerinin dna temelli bir araya getirilmesi

  1. Tez No: 383012
  2. Yazar: HASAN HÜSEYİN KAZAN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. CAN ÖZEN, DOÇ. DR. MESUT MUYAN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 91

Özet

Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET), moleküller arasında kesin bir uzaklık gerektirdiğinden, özellikle in situ ve in vivo olarak, protein-protein etkileşimi gibi moleküler dinamiklerin çalışılması için umut vaat eden bir analizdir. BRET, tekniğin zorunlu kıldığı lüciferaz enziminin ve inorganik floresan boyalar veya floresan proteinler gibi floresan moleküllerin bir araya getirilmesi ile in situ moleküler etkileşimlerin aydınlatılması, hayvan modellerinde derin doku görüntülemesi ve organik ya da inorganik moleküllerin in vitro olarak tespiti için kullanılmıştır. Lüsiferaz türevlerinin BRET çiftlerinden biri olması zorunluluğunun yanında, özellikle BRET tekniği üzerinden geliştirilen tespit çalışmalarında, tüm sistem, lüsiferaz sübstratının ya da istenilen uyarım ve emisyon dalga boylarında floresan moleküller kullanılarak optimize edilebilir. BRET'den çok daha önce tanımlanan ve moleküler etkileşim çalışmalarında sıkça tercih edilen Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) prensibine benzer olarak, BRET sistemleri temel olarak in situ çalışmalarda kullanılır fakat FRET'le kıyaslandığında açığa çıkan avantajları nedeniyle BRET sensör çalışmalarında da daha geniş yer bulabilmelidir. Deoksiribonükleik asit (DNA) yaşamın kaynağı olarak gösterilmekle birlikte durağan ve tahmin edilebilir yapısı ve sentetik varyantlarının ucuza üretilmesi gibi avantajlara sahip olan bir biyo-polimerdir. Bu avantajlar çerçevesinde DNA, moleküler kendiliğinden birleşim prensibine bağlı olarak, herhangi bir amaçla ya da sadece kavram kanıtı için moleküllerin üzerinde belirli uzaklıklarda yerleştirilebileceği iskele çalışmalarında kullanılmıştır. Sunulan çalışmada, tasarlanmış transkripsiyon faktörlerini BRET çifti olan Renilla lüsiferaz (RLuc) ve floresan bir protein olan mCherry'ye birleştirildiği ve bu parçaların DNA iskelesi üzerinde bir araya getirildiği bir BRET platformunun dizayn edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, RLuc komplementer DNA (cDNA)'sı insan östrojen reseptörü α (hERα)'nın modifiye edilmiş hali olan CDC DNA-bağlanıcı proteinin cDNA'sına ve mCherry cDNA'sı bir maya protein olan Gal4 DNA-bağlanıcı proteinin cDNA'sına, genel bir protein saflaştırma etiketi olan 6-Histidin (6xHis) ile bir bakteriyel ekspresyon vektörü içerisinde birleştirilerek klonlanmıştır. İlgili füzyon proteinlerini kodlayan plasmidlerin oluşturulması sonrasında çalışmanın sonraki aşamalarında kullanılacak füzyon proteinlerinin aşırı-ekspresyonu, izolasyonu ve saflaştırılması denenmiş ve tüm aşamalar Western Blotting Analizi ile doğrulanmaya çalışılmıştır. Henüz devam eden bir çalışma olarak, proteinlerin DNA'ya gerçekten bağlanıp bağlanmadığı biyokimyasal yöntemlerle kontrol edilecek ve BRET sinyali elde edilmeye çalışılacaktır. Dizayn edilmesi planlanan bu platformun, in situ çalışmalara aktarıldığında kompleks transkripsiyon mekanizmasının çalışılmasında, genom mühendisliği ve DNA-protein etkileşimlerinin çalışmalarında kullanılabileceği öngörülmektedir.

Özet (Çeviri)

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) is a promising assay for studying molecular dynamics such as protein-protein interactions especially in situ and in vivo since the system requires precise distance between the molecules. BRET technique has been used for identification of molecular interactions in situ, imaging of deep-tissues in animal models and sensing of organic or inorganic molecules in vitro by combining the luciferase derivative that is an obligatory unit for this assay and any fluorescent molecules, such as inorganic fluorescent molecules and fluorescent proteins. Beside the luciferase derivatives must be used as one part of BRET pairs, the overall system would be optimized to adapt desired properties by changing the substrate of the luciferase and fluorescent molecule with suitable excitation and emission wavelength as well as the platform that locates the BRET pairs particularly for sensing studies via BRET technique. As sharing the perspective of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) which was described previously and has been used widely in molecular interactions, BRET systems have been established basically on in situ studies; however, BRET could be used in sensing systems more widely thanks to its advantages over FRET technique. Deoxyribonucleic acid (DNA) has been shown as the source of life; nonetheless, it is a remarkable bio-polymer having stable and predictable structure with cheap production of synthetic variants. Basing on these useful properties of DNA, it has been used popularly to develop scaffold to combine molecules with exact distances for any purposes or proof of concept studies using molecular self-assembly principle. In the present study, we aimed to design a BRET assay in which engineered transcription factors are fused to BRET pairs, Renilla luciferase (RLuc) and fluorescent protein, mCherry, and signaled on DNA scaffold as a proof of concept study. We fused complementary DNA (cDNA) of CDC DNA-binding protein that is the engineered form of human estrogen receptor α (hERα) to cDNA of RLuc and cDNA of yeast protein, Gal4 DNA-binding domain to cDNA of mCherry with the common protein purification tag of 6-Histidine (6xHis) in a bacterial expression vector by cloning studies. Upon construction of the plasmids that code for related fusion proteins, we tried to over-express, isolate and purify the fusion proteins for next steps of the study and the final process was confirmed by Western Blot (WB) analysis. As an ongoing study, we will try to verify the binding of proteins to DNA scaffold by biochemical methods. Next, we will try to obtain BRET signal and optimize the overall system. This platform would be adapted to in situ and regarded to be used to study context-dependent transcription machinery, genome editing and protein binding to DNA.

Benzer Tezler

  1. Çinko nanotanecik içeren polimer nanokompozit malzeme üretimi ve karakterizasyonu

    Fabrication and characterization of polymer nanocomposite materials incorporated zno nanoparticles

    ALEV AKBAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SADRİYE KÜÇÜKBAYRAK OSKAY

  2. Investigation of the effect of electrical stimulation on proteotoxic models of caenorhabditis elegans

    Elektrik stimülasyonunun caenorhabditis elegans proteotoksik modeller üzerindeki etkilerinin incelenmesi

    BAHRİYE ERKAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. FUNDA ŞAR

  3. Revealing the role of MED 14 in Pol II transcription regulation

    Pol II transkripsiyon regulasyonunda MED14 fonksiyonunun belirlenmesi

    YASEMİN BARIŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyokimyaİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. MURAT ALPER CEVHER

  4. Comparative analysis of teafs and NP analysis to integrate interactome and transcriptome data to reveal response to C-pulse in Saccharomyces cerevisiae

    Etkileşim ve anlatım verisinin bütünleştirilmesi yöntemleri olan teafs ve NP analizi ile Saccharomyces cerevisiae?nin glikoz vurumuna tepkisinin karşılaştırmalı analizi

    MUHAMMED ERKAN KARABEKMEZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. BETÜL KIRDAR

  5. Constructing peptide (GEPI)-protein molecular hybrids by using genetic engineering methods for materials and medical applications.

    Malzeme ve medikal uygulamalar için gen mühendisliği yoluyla peptid (GEPI)-protein hibritlerin oluşması.

    DENİZ ŞAHİN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CANDAN TAMERLER

    PROF. DR. MEHMET SARIKAYA