DNA-based assembly of transcription factors for bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay
Biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) analizi için transkripsiyon faktörlerinin dna temelli bir araya getirilmesi
- Tez No: 383012
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CAN ÖZEN, DOÇ. DR. MESUT MUYAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 91
Özet
Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET), moleküller arasında kesin bir uzaklık gerektirdiğinden, özellikle in situ ve in vivo olarak, protein-protein etkileşimi gibi moleküler dinamiklerin çalışılması için umut vaat eden bir analizdir. BRET, tekniğin zorunlu kıldığı lüciferaz enziminin ve inorganik floresan boyalar veya floresan proteinler gibi floresan moleküllerin bir araya getirilmesi ile in situ moleküler etkileşimlerin aydınlatılması, hayvan modellerinde derin doku görüntülemesi ve organik ya da inorganik moleküllerin in vitro olarak tespiti için kullanılmıştır. Lüsiferaz türevlerinin BRET çiftlerinden biri olması zorunluluğunun yanında, özellikle BRET tekniği üzerinden geliştirilen tespit çalışmalarında, tüm sistem, lüsiferaz sübstratının ya da istenilen uyarım ve emisyon dalga boylarında floresan moleküller kullanılarak optimize edilebilir. BRET'den çok daha önce tanımlanan ve moleküler etkileşim çalışmalarında sıkça tercih edilen Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) prensibine benzer olarak, BRET sistemleri temel olarak in situ çalışmalarda kullanılır fakat FRET'le kıyaslandığında açığa çıkan avantajları nedeniyle BRET sensör çalışmalarında da daha geniş yer bulabilmelidir. Deoksiribonükleik asit (DNA) yaşamın kaynağı olarak gösterilmekle birlikte durağan ve tahmin edilebilir yapısı ve sentetik varyantlarının ucuza üretilmesi gibi avantajlara sahip olan bir biyo-polimerdir. Bu avantajlar çerçevesinde DNA, moleküler kendiliğinden birleşim prensibine bağlı olarak, herhangi bir amaçla ya da sadece kavram kanıtı için moleküllerin üzerinde belirli uzaklıklarda yerleştirilebileceği iskele çalışmalarında kullanılmıştır. Sunulan çalışmada, tasarlanmış transkripsiyon faktörlerini BRET çifti olan Renilla lüsiferaz (RLuc) ve floresan bir protein olan mCherry'ye birleştirildiği ve bu parçaların DNA iskelesi üzerinde bir araya getirildiği bir BRET platformunun dizayn edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, RLuc komplementer DNA (cDNA)'sı insan östrojen reseptörü α (hERα)'nın modifiye edilmiş hali olan CDC DNA-bağlanıcı proteinin cDNA'sına ve mCherry cDNA'sı bir maya protein olan Gal4 DNA-bağlanıcı proteinin cDNA'sına, genel bir protein saflaştırma etiketi olan 6-Histidin (6xHis) ile bir bakteriyel ekspresyon vektörü içerisinde birleştirilerek klonlanmıştır. İlgili füzyon proteinlerini kodlayan plasmidlerin oluşturulması sonrasında çalışmanın sonraki aşamalarında kullanılacak füzyon proteinlerinin aşırı-ekspresyonu, izolasyonu ve saflaştırılması denenmiş ve tüm aşamalar Western Blotting Analizi ile doğrulanmaya çalışılmıştır. Henüz devam eden bir çalışma olarak, proteinlerin DNA'ya gerçekten bağlanıp bağlanmadığı biyokimyasal yöntemlerle kontrol edilecek ve BRET sinyali elde edilmeye çalışılacaktır. Dizayn edilmesi planlanan bu platformun, in situ çalışmalara aktarıldığında kompleks transkripsiyon mekanizmasının çalışılmasında, genom mühendisliği ve DNA-protein etkileşimlerinin çalışmalarında kullanılabileceği öngörülmektedir.
Özet (Çeviri)
Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) is a promising assay for studying molecular dynamics such as protein-protein interactions especially in situ and in vivo since the system requires precise distance between the molecules. BRET technique has been used for identification of molecular interactions in situ, imaging of deep-tissues in animal models and sensing of organic or inorganic molecules in vitro by combining the luciferase derivative that is an obligatory unit for this assay and any fluorescent molecules, such as inorganic fluorescent molecules and fluorescent proteins. Beside the luciferase derivatives must be used as one part of BRET pairs, the overall system would be optimized to adapt desired properties by changing the substrate of the luciferase and fluorescent molecule with suitable excitation and emission wavelength as well as the platform that locates the BRET pairs particularly for sensing studies via BRET technique. As sharing the perspective of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) which was described previously and has been used widely in molecular interactions, BRET systems have been established basically on in situ studies; however, BRET could be used in sensing systems more widely thanks to its advantages over FRET technique. Deoxyribonucleic acid (DNA) has been shown as the source of life; nonetheless, it is a remarkable bio-polymer having stable and predictable structure with cheap production of synthetic variants. Basing on these useful properties of DNA, it has been used popularly to develop scaffold to combine molecules with exact distances for any purposes or proof of concept studies using molecular self-assembly principle. In the present study, we aimed to design a BRET assay in which engineered transcription factors are fused to BRET pairs, Renilla luciferase (RLuc) and fluorescent protein, mCherry, and signaled on DNA scaffold as a proof of concept study. We fused complementary DNA (cDNA) of CDC DNA-binding protein that is the engineered form of human estrogen receptor α (hERα) to cDNA of RLuc and cDNA of yeast protein, Gal4 DNA-binding domain to cDNA of mCherry with the common protein purification tag of 6-Histidine (6xHis) in a bacterial expression vector by cloning studies. Upon construction of the plasmids that code for related fusion proteins, we tried to over-express, isolate and purify the fusion proteins for next steps of the study and the final process was confirmed by Western Blot (WB) analysis. As an ongoing study, we will try to verify the binding of proteins to DNA scaffold by biochemical methods. Next, we will try to obtain BRET signal and optimize the overall system. This platform would be adapted to in situ and regarded to be used to study context-dependent transcription machinery, genome editing and protein binding to DNA.
Benzer Tezler
- Çinko nanotanecik içeren polimer nanokompozit malzeme üretimi ve karakterizasyonu
Fabrication and characterization of polymer nanocomposite materials incorporated zno nanoparticles
ALEV AKBAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SADRİYE KÜÇÜKBAYRAK OSKAY
- Investigation of the effect of electrical stimulation on proteotoxic models of caenorhabditis elegans
Elektrik stimülasyonunun caenorhabditis elegans proteotoksik modeller üzerindeki etkilerinin incelenmesi
BAHRİYE ERKAYA
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
BiyolojiKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FUNDA ŞAR
- Revealing the role of MED 14 in Pol II transcription regulation
Pol II transkripsiyon regulasyonunda MED14 fonksiyonunun belirlenmesi
YASEMİN BARIŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyokimyaİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MURAT ALPER CEVHER
- Comparative analysis of teafs and NP analysis to integrate interactome and transcriptome data to reveal response to C-pulse in Saccharomyces cerevisiae
Etkileşim ve anlatım verisinin bütünleştirilmesi yöntemleri olan teafs ve NP analizi ile Saccharomyces cerevisiae?nin glikoz vurumuna tepkisinin karşılaştırmalı analizi
MUHAMMED ERKAN KARABEKMEZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
BiyomühendislikBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. BETÜL KIRDAR
- Constructing peptide (GEPI)-protein molecular hybrids by using genetic engineering methods for materials and medical applications.
Malzeme ve medikal uygulamalar için gen mühendisliği yoluyla peptid (GEPI)-protein hibritlerin oluşması.
DENİZ ŞAHİN
Doktora
İngilizce
2011
Biyomühendislikİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CANDAN TAMERLER
PROF. DR. MEHMET SARIKAYA