Novel cellulase enzyme production towards biofuels sector by recombinant bacterium Escherichia coli
Biyoyakıt sektörüne yönelik yeni nesil selülaz enzimlerinin rekombinant Escherichia coli bakterisinde üretimi
- Tez No: 413553
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Genetik, Bioengineering, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Biyoyakıt, Selülaz, Rekombinant E. coli, Glikolizasyon, Glikoprotein, Biofuel, Cellulase, Recombinant E. coli, Glycosylation, Glycoprotein
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 94
Özet
Yenilenebilir bir enerji kaynağı olan biyoetanolün üretim prosesinde yer alan selülaz enzimlerinin, pH-stabil, termo-stabil ve ekonomik olması, ticari verimlilik açısından önem teşkil etmektedir. Mısır ve şeker kamışı gibi gıda hammaddeleri yerine selülozik biyokütleden biyoetanol eldesinde kullanılan endoglukanaz tipi selülazların üretim maliyetlerinin düşürülmesine yönelik geliştirilen proseste, konakçı hücrenin seçimi son derece önemlidir. E. coli bakterisi, rekombinant protein üretiminde en çok tercih edilen mikroorganizmaların başında gelmektedir ve glikozilasyon mekanizmalarının bakterilerde varlığı yakın zamanda keşfedilmiş, Campylobacter jejuni bakterisinde bulunan basit bir protein glikozilasyon gen bölgesi (pgl), E. coli bakterisine aktarılarak, endüstriyel önem teşkil eden bu bakteriye proteinleri glikozilleme yeteneği kazandırmıştır. Çalışmamızda, pET28a-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, pET28a-ssYebF-Cel5A-6xHis, pTrc99A-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, ve pTrc99A-ssYebF-Cel5A-6xHis plazmidleri tasarlanmış ve bu yeni plazmidlerin yanı sıra, pMAF_pglB ve/veya pPglΔB plazmidlerini de içeren onaltı yeni sistem geliştirilmiştir. Tasarlanan plazmidler standart genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak sentezlendikten sonra restriksiyon analizi ve DNA dizi analizi yönlemleri ile doğrulanmıştır. Doğal ve glikozillenmiş selülaz enzimleri (Cel5A) SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile doğrulanmıştır. Daha sonra selülaz üretiminin arttırılması amacıyla, (i) besi ortamı (ii) indükleyici konsantrasyonları, (iii) karbon kaynağı, (iv) ODind (v) indükleme sonrası ortam sıcaklığı, (vi) örnekleme zamanı, (vii) hücre parçalama koşulları gibi biyoproses koşulları optimize edilmiş ve DNS aktivite metodu modifiye edilmiştir. Biyoproses tam olarak geliştirilmiş ve sonuç olarak üretilen dört farklı selülazın aktiviteleri; hücre-içi doğal tip 21-kat (0.219 IU/mL'e); hücre-dışı doğal tip, 1.8-kat (0.302 IU/mL'e); glikozillenmiş hücre-içi tip, 68-kat (1.02 IU/mL'e); hücre-dışı doğal tip 3-kat (0.782 IU/mL'e) arttırılmıştır ve bu değer yakın zamanda rapor edilen glikozillenmemiş selülaza göre 6-kat daha yüksektir. Glikozillenmiş ve glikozillenmemiş enzimlerin her ikisi için de enzim kinetiği çalışmalarında yaklaşık aynı Km değeri elde edilmiş (3.2 mM), glikozilasyonun enzim aktif bölgesini etkilemediği düşünülmüştür. Rekombinant selülaz enzimi, biyoyakıtlar ve enerji sektöründeki darboğazı gidermesi açısından son derece önemlidir ve bu çalışma, daha da geliştirildiği takdirde, ticari ölçekli biyoetanol üretim prosesinde kritik öneme sahip olan selülaz enziminin üretim maliyetini düşürme potansiyeline sahiptir.
Özet (Çeviri)
Low cost, pH- and thermo-stable cellulase enzymes are important factors for commercially viable production of bioethanol, which is a renewable source of energy. Instead of food raw materials such as corn and sugar cane, ethanol obtained from cellulosic biomass by endoglucanase type of cellulase will reduce the production costs. Escherichia coli bacteria are one of the most preferred hosts for the production of recombinant proteins and the presence of glycosylation patterns in bacteria have been discovered recently, a simple protein glycosylation locus (pgl) found in the bacterium Campylobacter jejuni was transferred to E. coli, which gave the capability of bacterial protein glycosylation to this industrially important host. While cellulase enzymes produced in eukaryotic cells reveal the positive effects of glycosylation, glycosylated cellulase production in bacteria is not found in the literature. On the other hand, enzymes produced in bacterial systems are known to be more economical compared to eukaryotic cells. In this study, pET28a-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, pET28a-ssYebF-Cel5A-6xHis, pTrc99A-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, and pTrc99A-ssYebF-Cel5A-6xHis, plasmids were designed and sixteen new production systems were created by transforming these new plasmids with or without pMAF_pglB and/or pPglΔB, into E. coli CLM24 or E. coli BL21 (DE3). The designed plasmids were constructed using standard genetic engineering techniques and the sequence of the plasmids were confirmed with restriction digestion and DNA sequencing analysis. Glycosylated and wild-type cellulase enzymes (Cel5A) were analyzed and confirmed by SDS-PAGE and Western Blotting methods. Thereafter, in order to increase the cellulase production efficiency, bioprocess parameters; such as (i) growth media (ii) inducer concentration (iii) carbon source and additional supplements at growth phase (iv) ODinduction, (v) induction temprature, (vi) sampling time, (vii) cell lyses conditions were optimized and enzyme activity assay was modified. The bioprocess was fully developed and as a result; activity of four different systems that produce cellulase were increased as; intracellular cellulase 21-fold, up to 0.219 IU/mL; extracellular cellulase 1.8-fold, up to 0.302 IU/mL, glycosylated intracellular cellulase 68-fold, up to 1.02 IU/mL and glycosylated extracellular cellulase 3-fold, up to 0.782 IU/mL, which is 6-fold higher compared to a recently reported non-glycosylated cellulase. Enzyme kinetic studies revealed similar values for Km (ca. 3.2 mM) for both glycosylated and non-glycosylated enzyme, which suggested glycosylation does not affect the enzyme active site. The recombinant cellulase enzyme is extremely important for overcoming the bottlenecks in the biofuels and energy sector and with the development of bioprocess for cellulase production, this study has the potential to reduce the cost of overall bioethanol production, if improved further.
Benzer Tezler
- Bacillus mojavensis ve Bacillus vallismortis'ten alfa-amilaz üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Alpha amylase production, purification and characterization of Bacillus mojavensis and Bacillus vallismortis
ADEM KARAKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyolojiSiirt ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SADİN ÖZDEMİR
YRD. DOÇ. DR. ERDAL ÖĞÜN
- Sentetik organoselenyum bileşiklerinin antioksidan özelliklerinin incelenmesi
The investigation of the antioxidative properties of the synthetic organoselenium compounds
ZELİHA SELAMOĞLU
- Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
DR. GÜNSELİ KURT GÜR
- Arpa, yulaf ve buğdayın Lactobacillus salivarius kullanılarak katı faz fermantasyon ile besin madde bileşiminin zenginleştirilmesi
Value-added novel products based on whole grain flours fermented in an optimised solid state process using Lactobacillus salivarius
BURAK BARAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
ZiraatSüleyman Demirel ÜniversitesiZootekni Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SULHATTİN YAŞAR
- Discovery of new cellulose-hydrolyzing enzymes using metagenomic approach
Metagenomik yöntem kullanılarak selüloz parçalayan yeni enzimlerin keşfedilmesi
SEVDE ŞENCAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
DOÇ. DR. YAVUZ ÖZTÜRK