Discovery of new cellulose-hydrolyzing enzymes using metagenomic approach
Metagenomik yöntem kullanılarak selüloz parçalayan yeni enzimlerin keşfedilmesi
- Tez No: 421146
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR, DOÇ. DR. YAVUZ ÖZTÜRK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 87
Özet
Fosil yakıtlar tükenebilir kaynaklar olmakla birlikte tüketimleri çevreye zararlı kimyasalların salımına neden olmaktadır. Fosil yakıtların çevreye olan zararlarını azaltmak ve enerjinin sürdürebilirliğini sağlamak için alternatif enerji kaynaklarının geliştirilmesi gerekmektedir. Selülozik biyokütlelerin parçalanması ile elde edilen biyoyakıt enerji gereksiniminin karşılanması için yüksek potansiyelli bir alternatif olarak görülmektedir. Fakat bu alanda yürütülen yoğun araştırmalara rağmen sürdürülebilir ve ekonomik açıdan uygulanabilir biyoyakıt üretimi sağlanamamıştır. Bunun sebebi, selülozik yapının parçalanamaya dirençli yapısıdır. Günümüzde biyoyakıtın endüstriyel ölçüde üretiminin yapılmasının önündeki en büyük engel optimum düzeyde çalışan yüksek kaliteli enzimlerin eksikliğidir. Selülozun tamamen parçalanması birden fazla enzimin eş zamanlı çalışmasını gerektirmektedir. Selülozu parçalamakla görevli enzimler, selülazlar, yapılarına ve aksiyon mekanizmalarına bağlı olarak üç grupta sınıflandırılmışlardır: endoglukanaz, ekzoglukanaz ve beta-glukozidaz. Günümüzde amacına uygun optimum şartlarda çalışan enzimlerin yetersizliğinden dolayı selülazların ticari kullanımı sınırlıdır. Yeni enzimlerin keşfi için dikkat çeken yöntemlerden biri doğal çeşitliliğin uygun amaç doğrultusunda taranmasıdır. Her türlü çevresel koşulda yaşamaya adapte olmuş mikroorganizmalar yeni enzimlerin keşfi için önemli kaynak teşkil etmektedir. Metagenomik yaklaşım, çevresel örneklerden direkt DNA izolasyonunu içeren, bu sebeple kültivasyondan kaynaklanan genetik bilgi kayıplarını en aza indirgeyen bir yöntemdir. Bu yöntem ortamda bulunan tüm mikroorganizmanın genetik materyalinin kazanımını sağlamaktadır. Yapılan çalışmada metagenomik yöntem kullanılarak selüloz parçayan yeni enzimlerin keşfi amaçlanmıştır. Metagenomların eldesi için çeşitli ortamlardan örnekler elde edilerek metagenomik DNA izolasyonları yapılmıştır: Bu örnekler Dalaman Kaynak Suyu, Dalaman Gölü, Emet Kaplıcaları, Kuzuluk Kaplıcaları, Emet Kaplıcaları ve Dalaman Gölü'nde bekletilen samanlar, çiftlikte yetiştirilen ve TÜBİTAK MAM kampüsünden toplanan çekirgeler ve TÜBİTAK MAM kampüsünden alınan çürümeye başlamış çimendir. Metagenomik DNA'ların örneklerden izolasyonu için ticari kitler kullanılmıştır. İzolasyonu yapılan DNA'lar metagenomik kütüphanelerin oluşturulmasında kullanılmıştır. Kütüphane oluşturulurken üretici firmanın tarifine uygun şekilde ticari kit kullanılmıştır. HiSeq2500 (Illumina, ABD) dizileme sistemi ile tüm metagenom sekans dizilemesi gerçekleştirilmiştir. Dizileme sistemi ile okunan parçaların birleştirilmesinde, filogenetik çalışmalarda ve gen anotasyonunda biyoenformatik araçlardan yararlanılmıştır. Analizler sonucu metegenomlarda 1238 selülaz geni olduğu görülmüştür. Selülaz olarak anotasyonu yapılan genlerden 63 tanesi enzim keşfi için seçilmiştir. Her aday gene uygun özel primer çifti tasarlanmıştır ve uygun reaksiyon koşullarında metagenomik DNA'lar şablon olarak kullanılarak genler çoğaltılmıştır. Seçilen 63 genden 54 tanesi başarıyla çoğaltılmıştır. Amplifikasyonu yapılan genler pET-22b(+) vektörüne klonlanmıştır. Aday geni içeren pET-22b(+) vektörlerinin, proteinlerin ekspresyonu için, E. coli BL21 (DE3) suşuna transformasyonu yapılmıştır. Yapılan doğrulama sonucunda 54 genin başarı ile E. coli BL21 hücrelerine klonlandığı gözlemlenmiştir. Rekombinant protein üretimi besi ortamına 1 mM IPTG eklenerek indüklenmiştir.Aday genlerin SDS-PAGE ile analizleri sonucu 22 proteinin başarı ile üretildiği gözlemlenmiştir. Aday genlerinden başarıyla ekspres edilen 22 tanesi biyokatalitik aktivite için test edilmiştir. Endoglukanaz ve ekzoglukanaz aktivitesi için CMC substrat olarak kullanılırken, beta-glukozidaz için pNPG kullanılmıştır. Aktivite tayini CMC'ye karşı aktivite gösteren bir enzimin varlığı gösterirken, pNPG'ye aktivite gösteren enzim gözlemlenmemiştir. Genin spesifik aktivitesinin belirlenmesi için protein saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırılan proteinin miktar tayini Bradford yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Saflaştıran protein enzim aktivite testi için kullanılmış ve spesifik aktivite spektrometrik ölçümlerden yararlanılarak belirlenmiştir. Bulunan endoglukanaz enziminin spesifik aktivitesi bir miligram protein başına 0,44 ünite olarak hesaplanmıştır.
Özet (Çeviri)
Fossil fuel is a finite energy source and use of fossil fuels releases harmful chemicals to environment. To fulfill energy requirement, alternative energy sources that can replace fossil fuel must be developed. A high potential environmental friendly alternative is bio-fuel produced from cellulosic biomass. Despite of high number of biofuel researches, production of sustainable and economical biofuel remains a challenge due to recalcitrance of cellulosic materials. The major obstacle for industrial-scale production of biofuel is the inefficient degradation of plant material due to absence of enzymes that catalyze efficient hydrolysis at optimum conditions. Fully degradation of cellulose requires synergetic action of a complex of enzymes for optimized saccharification. Cellulases, which catalyze cellulolysis, are classified into three groups according to their structure and mechanism of action: endoglucanases, exoglucanases, and β-glucosidases. Unfortunately, commercial biocatalysis is insufficient due to the lack of enzymes with optimal performance for specific applications. A powerful approach, which draws attention lately, for discovery of new enzymes with optimum performance is screening of natural diversity. Microorganisms, which adapted to a wide range of environmental conditions, serve as a good source. Metagenomic approach, which comprises the direct extraction of genomic DNA from environmental samples, can prevent loss of diversity resulting from cultivation, and allows recovery of genomes of all microorganisms present in a given niche. In this study, the aim was identification of novel cellulolytic genes using metagenomic approach. Environmental samples used in the study comprised water samples from Dalaman Spring, Dalaman Lake, Emet Hot Spring, and Kuzuluk Hot Springs, straw samples that were incubated in water for enrichment of cellulolytic microorganisms, and grasshoppers obtained from TUBITAK MAM campus and commercial farm. The metagenomic DNA extraction and DNA clean-up (if required) were performed using commercial kits. The isolated DNAs were used for construction of metagenomic library with next-generation sequencing technology. Bioinformatic tools were used for assembly of reads, phylogenetic studies, and gene annotations. Total of 63 candidate cellulase genes were selected from annotated for further analysis. Candidate genes, which were amplified from metagenomic DNA, were cloned into E. coli BL21 (DE3) for production of recombinant protein. 22 of 63 candidate proteins was expressed successfully and screened for biochemical activity against cellulose. Two different substrate, CMC and pNPG, were used for screening of endoglucanases, exoglucanases, and β-glucosidases. Activity assay revealed one active enzyme against CMC, while no active protein that hydrolyzes pNPG was found.
Benzer Tezler
- Tokat-Reşadiye bölgesi bentonitinin duvar karosu bünyelerinde kullanılabilirliğinin araştırılması
Investigations of the applicability of Tokat-Reşadiye region bentonites in wall tile bodies
BÜŞRA ÇETİN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NECİP ÜNLÜ
- Dokuma kumaş tasarımı ve üretiminde termoplastik yapılı ipliklerle rölyef etkilerinin araştırılması
The research of relief effects in woven fabric design and production by thermoplastic structured yarns
ELİF KURTULDU
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Giyim EndüstrisiDokuz Eylül ÜniversitesiTekstil ve Moda Tasarımı Ana Sanat Dalı
PROF. NESRİN ÖNLÜ
- Recombinant production and characterization of chitinase enzyme from Pseudomonas mandelii KGI_MA19
Pseudomanas mandelii KGI_MA19 organızmasına ait kitinaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
EMİNE TUĞÇE SARAÇ CEBECİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Grafen esaslı yeşil nanokompozitlerin hazırlanması, karakterizasyonu ve çeşitli uygulamalarda kullanılması
Preparation and characterization of graphene-based green nanocomposites and their utilization in various applications
ESRA KILIÇ
- Characterization of xyloglucan endotransglycosylase (XET) enzymes from different plant species
Farklı bitki türlerinden ksiloglukan endotransglikozilaz (XET) enzimlerinin karakterizasyonu
MERVE SEVEN
Doktora
İngilizce
2017
BiyokimyaYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ANDREW JOHN HARVEY