Geri Dön

Bir gen modeli olarak nötral lipozomların bivalan metal iyonları ile birlikte kullanımının incelenmesi

Investigetion of the usage of neutral liposomes together with bivalent metal ions as a gene transfer model

PDF İndir

  1. Tez No: 414079
  2. Yazar: FATMA FUNDA DEMİRSOY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. HİLAL ÖZDAĞ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2015
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ankara Üniversitesi
  10. Enstitü: Biyoteknoloji Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 281

Özet

Gen tedavileri; kalıtsal, otoimmün, immün sistemi baskılayıcı ve kanser hastalıklarının iyileĢtirilmesinde kullanılmak üzere geliĢtirilen yöntemlerdir. Gen tedavisi amacıyla kullanılan viral vektörlerin aktarmak üzere taĢıdıkları DNA‟yı hücreye taĢırken hedefleri dıĢında olan hücreleri de enfekte edebilme, taĢıdıkları DNA‟yı konakçı genomunda entegre olmaması gereken bir bölgeye sokabilme gibi risklerinin bulunması nedeniyle gen tedavisindeki kullanımları sınırlanmaktadır. Gen tedavisinin önündeki bu sınırlamayı kaldırmak üzere hücreye DNA aktarımında plazma membranından geçebilme özelliğine sahip olan lipid vesikülleri denenmektedir. Gen transferi için kullanılan ve lipid veziküllerininin nükleik asitlerle beraber oluĢturduğu nanobileĢenler, genozom veya lipopleks adını almaktadır. Günümüzde insan gen tedavisi ile ilgili araĢtırmalarda alınan sonuçlar yalnızca tedavi edilmesi hedeflenen hücreye özgü gen aktarım araçları bulunmadığından henüz istenen verimde çalıĢmamaktadır. Lipid vesiküllerinin hücrelerin bulunduğu ortama verilmesinden gen ifadesine kadar giden yolda terapötik geni taĢıyan DNA‟yı degradasyondan koruyacak optimize edilmiĢ gen taĢıma sistemlerine ihtiyaç vardır. Yoğun olarak kullanılan katyonik lipitlerle yapılan lipofeksiyon deneyleri sıkça istenmeyen sitotoksisiteye neden olabilmekte, kontrolü zor olan serum stabilitesine olumsuz etki edebilmekte ve tüm bu olumsuzluklar nedeniyle düĢük transfeksiyon oranları ile sonuçlanmaktadır. Bu tez çalıĢmasında sitotoksik katyonik lipozomlar yerine, zwitteriyonik fosfolipitler, çift değerli katyonlar (Mg+2 ve Ca+2) ile DNA bir araya getirilerek toplaĢımlar oluĢturulmuĢ ve bu yapıların özellikleri ile kullanımları irdelenmiĢtir. Daha spesifik olarak çok katmanlı (MLV) ve tek katmanlı (ULV) fosfatidilkolin vezikülleri oluĢturulduktan sonra, çift valanslı metal katyonlarca tetiklenen DNA‟nın MLV ve ULV fosfatidilkolin vezikülleri üzerine adsorpsiyonu, agregasyonu ve adhezyonu UV/VIS spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Zwitteriyonik lipozomların termotropik faz değiĢimleri Mg+2 varlığında polinükleotitler ve çeĢitli DNA‟lar ile bileĢik oluĢturmaları termodinamik ölçümler ve floresan mikroskopisi ile incelenmiĢ ve çeĢitli elektrostatik lipit-nükleik asit bileĢiklerinin oluĢumları ile ilgili daha önce yayınlanan verilerle kıyaslanmıĢtır. Bu Ģekilde oluĢan üçlü bileĢiklerin (DNA, lipid, Mg+2) yüzey tanınma ve sınırlararası özellikleri Langmuir-Blodgett tek katman, titreĢim (FTIR ve Raman) spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Bu genozomların boyut ve morfoloji analizleri z-potansiyel, Dinamik IĢın Saçılımı (DLS) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Üçlü bileĢiklerin yapısal değiĢikleriyle ilgili termodinamik ve kinetik modellerin ortaya konmasına yönelik olarak Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (DSC), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Ġzotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC) ölçümleri yapılmıĢtır. Mg+2 varlığında DNA ile lipozomlar arasında meydana gelen füzyon olayları ise floresan ve konfokal mikroskopisi ile incelenmiĢtir. Transfeksiyon için etkili dairesel ve süpersarmallı plazmidlerin oluĢumu agaroz jel elektroforez ile gösterilmiĢtir. Spektroskopik ölçümlerle üçlü bileĢenlerin yapılarında yer alan biyomakromoleküllerin ikincil yapılarındaki yapısal değiĢiklikler gösterilmiĢtir. Mikroskobik ölçümler sonucunda üçlü oluĢumlar görsel olarak tanımlanmıĢ, boyut-potansiyel ölçümleri sonucunda görsel olarak TEM ile belirlenen sonuçlar teyit edilmiĢtir. Termal ölçümler ile biyodinamikleri ve oluĢum termodinamiği parametreleri hesaplanmıĢtır. Ayrıca lipit/DNA/(Mg+2 ve Ca+2) üçlü kompleksinin hücresel sisteme aktarılması için transfeksiyon deneyleri yapılmıĢ; metal katyonlarca (Me+2) gerçekleĢtirilen transfeksiyon etkinlikleri incelenmiĢtir. Bu üçlü toplaĢımın Mg+2 ile yapılan kısmında transfeksiyon gerçekleĢmiĢ ancak deney tekrarlanamamıĢtır. Lipit/DNA/Ca+2 ile transfeksiyon ise başarılı olmuştur.

Özet (Çeviri)

Gene therapies are developed for curing inherited, autoimmune, immune system suppressive and cancer diseases. The use of viral vectors in gene therapy is limited because viral vectors have the risk to infect cells other than targeted ones and the DNA they carry can integrate into an undesirable locus in the host genome . In order to overcome these limitations of gene therapy lipid vesicles capable to transfer DNA across cellular plasma membrane are being tested. Lipid vesicles used in gene transfer and the nanocomplexes they formed with nucleic acids are referred to as genosomes or lipoplexes. Nowadays, the results obtained in the field of human gene therapy are unsatisfactory, due to the lack of selective tools towards the targeted cells. There is a need for optimized lipid vesicle based gene carrying systems protecting the DNA from degradation throughout their routes from the application site to gene expression. Lipofection experiments undertaken with widely used cationic lipids frequently lead to undesired cytotoxicity and has negative effec t on serum stability. Thus their transfection rates are low. In this thesis the use of zwitterionic phospholipids, forming assemblies with divalent metal cations (Ca2+ and Mg2+) with DNA and the potential use of these structures were investigated. More specifically, upon multilamellar (MLV) and unilamellar (ULV) phosphatidylcholine vesicle formations, the DNA adsorption, aggregation and adhesion onto these vesicles, triggered by divalent metal cations, were analyzed by UV/VIS spectroscopy. The thermotropic phase transitions, the complex formations between polynucleotides and various DNA in the presence of Mg2+ were studied by thermodynamic measurements and fluorescence microscopy. The results were compared to previously reported electrostatic lipid-nucleic acid formations. The surface recognition and interfacial properties of the formed ternary complexes (DNA/lipid/Mg2+) were investigated by Langmuir-Blodgett monolayers and vibrational (FTIR and Raman) spectroscopy. Size and morphology analyses of these genosomes were undertaken by z-potential and Dynamic Light Scattering (DLS) measurements. Thermodynamic and kinetic models concerning structural changes of ternary complexes were built based on Differential Scanning Calorimetry (DSC), Thermogravymetric Analysis (TGA) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). Fusion events occuring between DNA and liposomes in the presence of Mg2+ were analyzed by fluoresence and confocal microscopies. Transfection competent circular and supercoiled plasmid formations were shown by agarose gel electrophoresis. Secondary structural changes of biomacromolecules engaged in ternary complex formations were shown by spectroscopic measurements. Ternary formations were depicted visually by microscopic measurements and the obtained results on their sizes were verified by Transmission Electron Microscopy (TEM). Their biodynamical features and formation thermodynamic parameters were estimated by thermal measurements. Moreover, the cellular transfers of lipid/DNA/(Mg2+ and Ca2+) ternary complexes were analyzed by transfection experiments and the transfection efficiencies trigerred by metal cations (Me2+) were determined. Transfection studies based on these ternary complexes and Mg2+ were accomplished but these results cannot reproduced. Transfections based on lipid/DNA/Ca2+ system were successful.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    720151

    Recombinant production and characterization of aquaporin protein isolated from geobacillus thermoleovorans ARTR1 and virgibacillus sp. agtr strains

    Vırgıbacıllus sp. agtr, geobacıllus thermoleovorans ARTR1 suşlarından izole edilen akuaporin proteininin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    ŞEVVAL UYSALCAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

    DR. ÖĞR. ÜYESİ NACİYE ESRA ATEŞ GENCELİ

  2. Tez No

    887135

    Complete mitochondrial phylogeny of palaearctic serotine bats (Genus eptesicus, vespertilionidae, chiroptera)

    Palaearktik geniş kanatlı yarasaların tüm mitokondriyal genom filogenisi (Cins eptesicus, vespertilionidae, chiroptera)

    GAMZE ÖZBAY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İklim ve Deniz Bilimleri Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EMRAH ÇORAMAN

  3. Tez No

    267052

    Sıçanlarda oluşturulan deneysel alerjik rinit modelinde topikal intranazal doksisiklin etkilerinin incelenmesi

    The effects of topical intranasal doxycycline treatment in the rat allergic rhinitis model

    MEHMET ÖZGÜR AVİNÇSAL

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Kulak Burun ve BoğazDokuz Eylül Üniversitesi

    Kulak Burun Boğaz ve Baş-Boyun Cerrahisi Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ENİS ALPİN GÜNERİ

  4. Tez No

    521383

    Design of chitosan-based carriers for biomedical engineering applications

    Biyomedikal mühendisliği uygulamaları için kitosan bazlı taşıyıcıların tasarımı

    UĞUR BOZÜYÜK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SEDA KIZILEL

  5. Tez No

    669202

    Genetic and environmental interventions altering the course of brain aging: Evidence from the zebrafish (danio rerio) model

    Beyin yaşlanmasını değiştiren genetik ve çevresel müdahaleler: Zebrabalığı (danio rerio) modelinden bulgular

    ELİF TUĞCE KAROĞLU ERAVŞAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Nörolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Nörobilim Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MICHELLE MARIE ADAMS

Geri Dön