Geri Dön

Recombinant production and characterization of aquaporin protein isolated from geobacillus thermoleovorans ARTR1 and virgibacillus sp. agtr strains

Vırgıbacıllus sp. agtr, geobacıllus thermoleovorans ARTR1 suşlarından izole edilen akuaporin proteininin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 720151
  2. Yazar: ŞEVVAL UYSALCAN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER, DR. ÖĞR. ÜYESİ NACİYE ESRA ATEŞ GENCELİ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 103

Özet

Hücreler, hücre zarlarının yapısını oluşturan ve içerisinde proteini, karbonhidratı, kolestrolü bulunduran hücre için hayati öneme sahip organik ve inorganik moleküllerin, iyonların ve suyun geçisini sağlayan akışkan mozaik modele sahiptir. Hücrenin zarında bulunan bu proteinler biyolojik zar proteinleri olarak adlandırılırlar ve tüm proteinlerin yaklaşık % 25-30'unu oluştururlar. Fakat, zar proteinlerinin kısmen hidrofobik yüzeyleri, esneklikleri ve stabilite eksiklikleri nedeniyle hala büyük ölçüde aydınlatılmamış bir alandır. Biyolojik zar proteinleri bulundukları yere bağlı olarak iki alt katagoride incelenirler. Biyolojik zar proteinlerinden biri olan integral zar proteinleri, hücre zarına kalıcı olarak bağlanır. Bu proteini biyolojik zardan ayırmak için deterjanlar, polar olmayan çözücüler veya bazen denatüre edici maddeler kullanılır. Periferik zar proteinleri ise zara veya integral zar proteinlerine hidrofobik, elekstrostatik ve diğer kovalent olmayan etkileşimler ile geçici olarak bağlanırlar. Bu proteinler yüksek pH veya yüksek tuz konsantrasyonu içeren bir çözelti ile muamelenin ardından zardan ayrışabilirler. Günümüzde yukarıda bahsi geçen biyolojik zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmaları, zar proteinlerinin yapısal çalışmaları için gerekli olan aşırı ekspresyonu ve üretimindeki zorluklar nedeniyle büyük ölçüde engellenmiştir. Diğer protein sınıflarıyla karşılaştırıldığında, zar proteinlerinin yapılarının belirlenmesi, ekspresyonundaki ve saflaştırılmasındaki zorluk nedeni ile büyük ölçüde engel ile karşılaşılmaktadır. Tıbbi ve endüstriyel açıdan büyük öneme sahip bir biyolojik zar proteini olan aquaporinler hücre zarlarında gözenekler oluşturan, hücreler arasında suyun taşınmasını kolaylaştıran transmembran integral proteinlerdir. Su moleküllerinin geçişine izin verirken diğer tüm çözünen maddeleri reddeden zar proteinidir. Farklı hücre zarlarından akuaporin keşfi üzerine çok sayıda araştırma yapılmıştır. Birçok canlı organizma, zarlarında yüksek su hareket kapasitesi sağlayan akuaporin kanal proteinlerine sahiptir. Prokaryotik hücrelerde endüstriyel alanda biyomimetik membran yapımı ile ön planda olan aquaporinler, bitki hücrelerinde hücrenin hayati koşullarını sağlayan moleküllerin geçişini ve bazı stres koşulları (kuraklık) sırasında gerekliliği ile bilinirken, memeli aquaporinleri ise birçok hastalıkla özellikle lösemi ile ilişkilendirilmektedir. Bu doğrultuda yapılan çalışmalar sırasında karşılaşılan en büyük zorluk integral biyolojik zar proteini olan aquaporinlerin aşırı ekspresyonunun sağlanması ve sonrasında saflaştırılmasının optimizasyonunun sağlanmasındaki engellerdir. Akuaporinler, altı transmembran sarmal bölümden oluşan akuaporin monomerleri ve dar sulu gözenekle bağlanan sitoplazmik ve hücre dışı vestibülleri çevreleyen iki kısa sarmal bölümden oluşan temel yapıya sahiptirler. Sarmallar arasında, asparagin-prolin-alanin (“NPA motifi”) desenine sahip, ikisi hidrofobik (B, E) olmak üzere hücre zarının içine veya dışına kıvrılan beş bölge (A-E) vardır. Kanaldaki bir diğer kısım, akuaporinin seçici olarak farklı moleküllerin geçişine izin vermesini veya engellemesini sağlayan bir amino asitler kümesi olan“ar / R seçicilik filtresi”dir. Akuaporinler, hücre zarından su transferinde 10-100 kata kadar artış sağlarlar. Ayrıca bu proteinler, hücre dışı sinyallerin iletimi veya maddelerin zar yoluyla taşınması gibi çeşitli kritik roller de oynarlar. Benzersiz özellikleri nedeniyle, yapı ve aktivite analizi veya yeni biyo-taklit materyalleri dahil olmak üzere farklı amaçlar için yüksek miktarda üretilmelerine ihtiyaç duyulmaktadır. Yapısında bulunan Arginin aminoasidinden dolayı pozitif yüklü enerji bariyeri oluşturmaktadır. Bu şekilde, akuaporin yüklü veya nötral özellikte olan çözücülerin geçişini engellemektedir. Son 5 yılda akuaporinlerin rekombinant üretimi, genetik, doku lokalizasyonu, gelişimsel ve düzenlenmiş ekspresyonu, transgenik fare modelleri ve yapı / fonksiyon analizleri üzerine yayınlanan 500'den fazla çalışmada akuaporinlerin biyolojisine (AQP'ler) karşı büyük ilgi oluşmuştur. Bakterilerden memelilere kadar bütün hücrelerde bulunan akuaporinler literatürde araştırıldığında, çoğunlukla AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 ve AQP8 türlerinin suya özel olduğu görülmektedir. AQP3, AQP7 ve AQP9 ise akuagliseroporinler olarak adlandırılır ve ayrıca gliserol ve / veya diğer küçük yüksüz molekülleri taşımaktadır. Şu ana kadar rekombinant akuaporinle ilgili yapılan çoğu çalışmada, akuaporinlerin fonksiyonel, düzenleyici veya yapısal çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bahsedilen bu çalışmaların yanı sıra yüksek su geçirgenliği ve yüksek çözünen madde reddine sahip akuaporinlerin, suyun tuzdan arındırılması ve yeniden kullanılması için biyomimetik membranlarla kullanılması son yıllarda büyük ilgi görmektedir. Prokaryotik akuaporinler ilk olarak Escherichia coli 'de tanımlanmıştır ve bugüne kadar akuaporin proteini saflaştırmak için yapılan çalışmalarda Rhodobacter sphaeroides, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Mathanothermobacter marburgensis, Photobactetrium profundum SS9 ve Halomonas elongate gibi mikroorganizmalar kullanılmıştır. Aynı zamanda, hücre içermeyen protein ekspresyon sistemleri (cell-free expression systems) gibi yöntemler kullanılarak akuaporinlerin rekombinant olarak üretilmesinde avantaj sağlayacak çalışmalarda bulunmaktadır. Prokaryotik AQP'ler ile yapılan çalışmalar bakterilerin, ozmotik, oksidatif stres ve beslenme dalgalanmalarıyla başa çıkmasına yardımcı olduğunu göstermektedir. Fakat literatürde prokaryotik organizmalardan ve özellikle ekstrem koşullardaki prokaryotlardan üretilen akuaporinler için sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Yüksek tuz oranına sahip bir göl olan Acıgöl'den (Burdur, Türkiye) izole edilen Virgibacillus sp. AGTR suşu, halofilik yeni bir suş olarak literatürde yerini almıştır. Bu organizmanın genom bilgileri elde edilmiş ve biri 831 diğeri 795 baz uzunluğu olmak üzere iki adet aquaporin kodlayan gen bulundurduğu tespit edilmiştir. Bir başka ekstrem ortama sahip Armutlu'dan (Yalova) sediment örnekleri alınmış ve buradan da termofilik bir bakteri olan Geobacillus thermoleovorans ARTR1 izole edilmiştir. Bu organizmanın da 819 baz uzunluğunda akuaporin kodlayan gen dizisi belirlenmiştir. Ekstremofilik aquaporinlerin zorlu şartlar gerektiren endüstriyel kararlılıklarını analiz etmek amacıyla literatürde herhangi bir çalışması bulunmayan bu ekstrem organizmalardan toplamda 3 adet ekstremofilik akuaporin geni izole edildi. İzole edilen bu genler pET28a (+) vektörüne aktarılarak, Escherichia coli C43 konakçı hücresinde rekombinant olarak üretildi. Bu süreçte, uygun primerler ile yapılan PZR yöntemi ile ilgili genler çoğaltıldı ve pET28a (+) vektörü ile ligasyonu sağlandı. Transformasyon işlemi ile konakçı hücreye transfer edilen ilgili geni içeren plazmitler daha sonrasında SacI ve NotI restriksiyon enzimleri ile kontrol kesimi ve koloni PZR kurularak doğruluğu sağlandı. Uygun koşullarda büyütülen hücreler, IPTG ile indüklenerek proteinin aşırı ekspresyonu sağlanmıştır. Optimal koşul olan 1 mM IPTG, 37 ℃ ve 4 saat indüksiyon seçildi. Bu optimal koşulda görünür bir şekilde gen ifadesi sağlandı. Protein sonikasyon işleminden sonra uygulanan santrifüjde oluşan inklüzyon cisminde kaldığı gözlemlendiği için, santrifüj sonrası pellet ile devam edilmiş ve kontrol amaçlı ayrıca süpernatant SDS-PAGE ile incelenmiştir. Bu süreçten sonra ise protein çeşitli His-tag saflaştırma yöntemi kullanılarak saf olarak elde edildi. Ortalama 29 kDa boyutunda görülmesi beklenen proteinler SDS-PAGE ve Western Blot Analizleri ile teyit edilmiştir. Lipozomlar, kolesterol ve toksik olmayan doğal fosfolipidlerden oluşturulabilen, küresel şekilli küçük yapay keseciklerdir. Boyutları ve hidrofobik ve hidrofilik karakterleri (biyouyumluluğun yanı sıra) nedeniyle, lipozomlar ilaç dağıtımı için umut verici sistemlerdir. Lipozom özellikleri, lipid bileşimi, yüzey yükü, boyutu ve hazırlama yöntemi ile önemli ölçüde farklılık gösterir. Ayrıca, çift katmanlı bileşenlerin seçimi, çift katmanın 'sertliğini' veya 'akışkanlığını' ve yükünü belirler. Lipozomlar hücre zarını taklit edebilir. Lipozomların hazırlanması için doğal veya ilgili lipidler kullanılır. Akuaporinin uygun koşullarda lipozoma entegrasyonu ile oluşan proteolipozom sayesinde proteinler karakterizasyona hazır hale gelir. Lipozomlar, insan hücrelerinin lipid çift katmanlı zarlarında bulunan ve fizyolojik olarak kabul edilebilir doğal veya sentezlenmiş fosfolipidlerdir. Bu çalışmada fosfatidilkolinlerin (PC) bir örneği olan DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin) kullanılmıştır. Proteolipozom ise aquaporin içeren lipozomlardan oluşmaktadır. 2.5 mg/ml DOPC lipidi için 0.5 mg/ml konsantrasyonu olan aquaporin 10 ml PBS ile çözülüp 0.05M OG deterjanı eklenerek proteolipozom elde edilmiştir. Kontrol lipozomu ve proteolipozomu 0.85 M NaCl ile muamele edilip durağan akışlı ışık saçılım spektrometre cihazı ile aquaporinlerin su transfer hızı ölçülmüştür. Burada, aquaporinli lipozomların su geçişinin daha hızlı olduğu belirlenmiştir. Aquaporin taşıyan proteolipozomlar kontrol lipozomlarına kıyasla çok daha yüksek bir hızda su kaybetmektedirler. Bu da Geobacillus Thermoleovorans ARTR1 suşundan elde edilen aquaporinin çalıştığının göstergesi olarak açıklanmıştır. Bu proje kapsamında akuaporin proteinlerinin halofilik ve termofilik bakteriler gibi ekstrem koşullarda yaşayan bakterilerden tanımlanması ve karakerizasyonunun gerçekleştirilecek olması literatüre sağlayacağı katkı açısından büyük önem taşımaktadır.

Özet (Çeviri)

Cells have a fluid mosaic model that provides the passage of organic and inorganic molecules, ions and water, which are survival for the cell, that form the structure of cell membranes and contain protein, carbohydrates and cholesterol. Proteins located in the membrane of the cell are called biological membrane proteins and they constitute approximately 25-30 % of all proteins. However, the partially hydrophobic surfaces of membrane proteins are still a largely unconquered area due to their lack of flexibility and stability. Biological membrane proteins have three subgroups depending on their location are analyzed in category. Integral membrane proteins, one of the biological membrane proteins which are permanently attached to the cell membrane. Detergents, non-polar solvents, or sometimes denaturing agents are used to separate this protein from the biological membrane. Integral membrane proteins are a permanent part of the membrane and can penetrate the membrane to form transmembrane proteins. Peripheral membrane proteins, another biological membrane protein, temporarily bind to the membrane or integral membrane proteins by hydrophobic, electrostatic, and other non-covalent interactions. These proteins can dissociate from the membrane after treatment with a solution containing a high pH or high salt concentration. Lipid-anchored proteins, on the other hand, are proteins on the surface of the cell membrane that covalently bind to lipids embedded in the cell membrane. Today, the structural and functional studies of the above-mentioned biological membrane proteins have been largely hampered by the difficulties in their production and overexpression, which are necessary for the structural studies of membrane proteins. Compared to other protein classes, the determination of the structure, expression, and purification of membrane proteins is greatly hampered by difficulties. Aquaporin, a biological membrane protein of great medical and industrial importance, are integral proteins that form pores in cell membranes and facilitate the transport of water between cells. This protein is the membrane protein that allows the passage of water molecules and rejects all other solutes. In the literature, there is a number of researches on the discovery of aquaporin from different cell membranes.While aquaporins, which are at the forefront of biomimetic membrane production in prokaryotic cells in the industrial area, are known for the passage of molecules that provide the vital conditions of the cell in plant cells and their necessity during some stress conditions (drought), in mammalians aquaporins are associated with many diseases, especially leukemia. The biggest difficulty encountered during the studies carried out in this direction is the obstacles in ensuring the overexpression of the integral biological membrane protein aquaporins and the optimization of their purification afterwards. Aquaporins have a similar basic structure: aquaporin monomers consist of six transmembrane helical segments and two short helical segments surrounding cytoplasmic and extracellular vestibules connected by narrow aqueous pore. Between the helices are five regions (A-E) with an asparagine-proline-alanine (“NPA motif”) pattern, two of which are hydrophobic (B, E) that fold in or out of the cell membrane. Another part of the channel is the“ar/R selectivity filter”, a set of amino acids that allows aquaporin to selectively allow or block the passage of different molecules. Aquaporin monomers can assemble as tetramers in membranes, with each monomer functioning independently. The primary function of most aquaporins is to transport water across cell membranes in response to osmotic gradients created by active solute transport. Aquaporins provide a 10-100-fold increase in water transfer across the cell membrane. Because of their unique properties, they need to be produced in large quantities for different purposes, including structure and activity analysis or new biomimicry materials. Different species of aquaporins may have different permeability and rejection properties for the same solute. While aquaporin may vary depending on solute concentrations, the selectivity of aquaporin also varies depending on load and size. It creates a positively charged energy barrier due to the amino acid Arginine in its structure. In this way, aquaporin prevents the passage of loaded or neutral solvents. Over the past 5 years, there has been great interest in the biology of aquaporins (AQPs) in over 500 studies published on aquaporin cloning, genetics, tissue localization, developmental and regulated expression, transgenic mouse models, and structure/function analyzes. When aquaporins, which are found in all cells from bacteria to mammals, are investigated in the literature, it is seen that mostly AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 and AQP8 species are water specific. AQP3, AQP7 and AQP9 are called aquaglyceroporins and also carry glycerol and/or other small uncharged molecules. Most studies on recombinant aquaporins have so far been functional, regulatory or structural studies of aquaporins. In addition to these studies, the application of aquaporins with high water permeability and high solute rejection with biomimetic membranes for water desalination and reuse has attracted great interest in recent years. Prokaryotic aquaporins were first identified in Escherichia coli, and microorganisms such as Rhodobacter sphaeroides, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Mathanothermobacter marburgensis, Photobactetrium profundum SS9 and Halomonas elongate have been used in studies to purify aquaporin protein. Also the recombinant production of aquaporin is being studied by using cell-free expression systems. Studies with prokaryotic AQPs show that bacteria help cope with osmotic, oxidative stress and nutritional fluctuations. However, there are limited studies in the literature for aquaporins produced from prokaryotic organisms and especially prokaryotes under extreme conditions. Virgibacillus sp. AGTR strain isolated from Acıgöl (Burdur, Turkey), which is a lake with high salinity has taken its place in the literature as a new halophilic bacterium strain. The genome information of this organism was obtained, and it was determined that it contains two aquaporin-encoding genes, one of which is 831 bp and the other 795 bp. Also, a new thermophilic bacterium Geobacillus thermoleovorans ARTR1 was isolated from another extreme environment, Armutlu (Yalova). The gene sequence encoding aquaporin with a length of 819 bp was determined in this organism. To analyze the stability of extremophilic aquaporins in industrial processes requiring harsh conditions (high temperature, high pH), in total, three extremophilic aquaporin genes were isolated from both halophilic Virgibacillus sp. AGTR and thermophilic Geobacillus thermoleovorans ARTR1 strains. These isolated genes were transferred to the pET28a (+) vector and produced recombinantly in the Escherichia coli C43 host cell. In this process, genes related to the PCR method with appropriate primers were amplified and ligated with a pET28a (+) vector. IPTG induction was subjected to time, temperature, and molarity trials, respectively. Then the optimal condition of 1 mM IPTG, 37 °C and 4 hours induction was selected. Under this optimal condition, gene expression was visibly achieved. Since it was observed that the protein remained in the inclusion body formed in the centrifuge after sonication, it was continued with the pellet after centrifugation and examined by SDS-PAGE in the control supernatant. After this process, the protein was obtained purely by various His-tag purification methods. Proteins expected to appear at an average size of 29 kDa were confirmed by SDS-PAGE and Western Blot Analysis. Liposomes are small artificial vesicles of spherical shape that can be formed from cholesterol and non-toxic natural phospholipids. Because of their size and hydrophobic and hydrophilic character (as well as biocompatibility), liposomes are promising systems for drug delivery. Liposomes can mimic the cell membrane. Different lipid compositions can be used to obtain the desired liposome type. DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), an example of Phosphatidylcholines (PC), was used in this study. The proteoliposome consists of liposomes containing aquaporin. For 2.5 mg/ml DOPC lipid, aquaporin with a concentration of 0.5 mg/ml was dissolved in 10 ml of PBS and 0.05M OG detergent was added to obtain a proteoliposome, and aquaporin-free liposome was obtained. Control liposome and proteoliposome were treated with 0.85M NaCl and the water transfer rate of aquaporins was measured with a steady flow light scattering spectrometer device. Here, it was determined that the water passage of liposomes with aquaporin was faster. Aquaporin-bearing proteoliposomes lose water at a much higher rate than control liposomes. This was explained as an indication that aquaporin obtained from the Geobacillus Thermoleovorans ARTR1 strain was working. The identification and characterization of novel aquaporin proteins from both halophilic and thermophilic bacteria within the scope of this project are of great importance in terms of their contribution to the literature.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    772209

    Recombinant production and characterization of a novel N-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp. infantis 157F

    Recombinant production and characterization of a novel n-glycosidase (EndoBI-2) from Bifidobacterium longum subsp.infantis 157F

    HATİCE DUMAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  2. Tez No

    688848

    Recombinant production and characterization of serine protease enzyme from Virgibacillus sp. AGTR strain using site directed mutagenesis

    Virgibacillus sp. AGTR suşundan izole edilen serin proteaz enziminin bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EVRİM KAPUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  3. Tez No

    740030

    Recombinant production and characterization of chitinase enzyme from Pseudomonas mandelii KGI_MA19

    Pseudomanas mandelii KGI_MA19 organızmasına ait kitinaz enziminin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    EMİNE TUĞÇE SARAÇ CEBECİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER

  4. Tez No

    542765

    İnsülin benzeri bağlayıcı proteinlerin (IGFBP) rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

    Recombinant production and characterization of insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP)

    ZEYNEP ERİM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyokimyaEge Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BURCU OKUTUCU

  5. Tez No

    675991

    Recombinant production and characterization of new bifidobacterial glycosidases

    Yeni bifidobakteri glikosidazlarinin rekombinant olarak üretilmesi ve karakterizasyonu

    BERFİN SUCU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

Geri Dön