Thermostabilization of Panomycocin, a novel exo-beta-1,3-glucanase isolated from Pichia anomala NCYC 434, by using excipients and computational methods
Pichia anomala NCYC 434'ten izole edilmiş yeni bir ekzo-beta-1,3-glukanaz olan Panomikosin'in yardımcı maddeler ve bilgisayar programlar kullanılarak termostabilitesinin artırılması
- Tez No: 441988
- Danışmanlar: PROF. DR. KADRİ FATİH İZGÜ, DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2015
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 144
Özet
Mantar enfeksiyonlarına neden olan risklerin artmasıyla, invaziv mantar hastalığı yaygınlaşmıştır. Bundan dolayı antifungal ilaçlarına talep artmıştır. Ayrıca şu anda kullanılmakta olan antifungal ilaçların etki mekanizmalarından dolayı ciddi yan etkileri bulunmaktadır ve onlara karşı direnç gelişmektedir. Dolaysıyla etki mekanizmaları memeli hücrelerini etkilemeyen yeni antifungal ilaçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Doğal ortamda oluşan toksik, maya öldürücü proteinler bunun gibi ilaçlara iyi bir örnek teşkil etmektedir. Panomikosin de bu tür öldürücü proteinlere örnektir. Panomikosin Pichia anomala NCYC 434 maya suşunun (K5) öldürücü toksinidir. Ekzo-β-1,3-glukanaz aktivitesi bulunmaktadır. Mantar hücresinin duvar bütünlüğünün korunmasında önemli olan β-1,3-glukanı hidrolize ederek proteine karşı hassas olan hücreleri öldürür. Ancak 37ºC'den sonra proteinin aktivitesi azalmaktadır. Bu çalışmada Panomikosin'nin termostabilitesinin çeşitli yardımcı maddeler kullanılarak artırılmasıyla daha yüksek sıcaklıklarda etkin olması amaçlanmıştır. Çeşitli konsantrasyonlarda hazırlanan yardımcı maddeler protein ile birlikte Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006 üzerinde sıcaklığı artırarak denenmiştir. Yardımcı maddeler protein termostabilitesini arttırmasını sağlarsa Panomikosin'in yeni bir antifungal ilaç olarak formülasyon geliştirilmesinde kullanılabilecek yardımcı maddeleri seçme fırsatı verecektir. Yardımcı maddelerin termostabilite üzerindeki etkileri sınırlı olduğundan daha yüksek sıcaklıklarda termostabil olan bir protein tasarlamak için bilgisayar programlar da kullanılmıştır. Önce proteinin homoloji modellemesi yapılmıştır. Proteinin bağlanma noktaları bulunduktan sonra çeşitli programlar ve serverler kullanılarak geliştirilmiş model üzerindeki en iyi termostabilize eden noktalar tespit edilmiştir. Test edilen yardımıcı maddelerin proteinin termostabilitesini artırmamasına rağmen mutasyon ile termostabiliteyi istenilen dereceye artırabilen model üzerindeki en iyi amino asit noktaları tespit edilmiştir. Proteinin alosterik bölgesinde Leu52Arg, Phe223Arg ve Gly254Arg mutasyonlar sırasıyla 6.26 K, 6.26 K ve 8.27 K sıcaklık artışı sağlayabilecek en iyi termostabilize eden noktalar oldukları bulunmuştur. Bağlanma noktasında Glu186Arg mutasyonu 9.58 K sıcaklık artışı sağlayabilecek en iyi termostabilize eden nokta olduğu bulunmuştur. Sonucu kullanarak mutant termostabil protein elde edilebilir ve bu da termostabilitesi yüksek olan yeni bir antifungal ilaç olan Panomikosin formülasyonun yapılmasında yardımcı olacaktır.
Özet (Çeviri)
As the risks for fungal infections increased, the prevalence of invasive fungal infections increased. Therefore, the demand for antifungal agents has risen. Moreover, the currently used antifungal agents have serious side effects and resistance development resulting from their mechanisms of action. Thus, novel antifungal agents with mechanisms that will not affect the host mammalian cells are in need. Yeast killer proteins which are naturally occuring toxins are good candidates for such types of agents. Panomycocin is an example for this type of killer proteins. Panomycocin is a killer toxin of Pichia anomala NCYC 434 (K5). It has exo-β-1,3-glucanase activity. It kills the sensitive cells by hydrolyzing β-1,3-glucans that are crucial in maintaining the integrity of fungal cell wall. However, its activity decreases above 37ºC. In this work various types of excipients were used to increase the thermostability of Panomycocin so that it would be active at higher temperatures. Gradient concentrations of these excipients along with the protein were tested on Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006 at increasing temperatures. If the excipients tested increase the thermostability, this will give us the opportunity to choose suitable excipients that can be used in the formulation of Panomycocin as a novel antifungal drug. Since the effect of excipients on thermostability is limited, computational methods were also used to design a thermostable protein at much higher temperatures. Homology modeling of the protein was performed first. After the binding site of the protein was predicted, the best thermostabilizing positions in the model generated were detected utilizing various computer programs and servers. Although the excipients tested did not increase the thermostability of the protein, we found the best amino acid residues in the model whose substitutions can increase the thermostability of the protein to the desired level. In the allosteric part of the protein Leu52Arg, Phe223Arg and Gly254Arg were found to be the best thermostabilizing mutations with 6.26 K, 6.26 K and 8.27 K temperature increases respectively. In the binding site Glu186Arg was found to be the best thermostabilizer mutation with 9.58 K temperature increase. Using the results mutant thermostable protein can be obtained and this will enable the formulation of Panomycocin as a novel antifungal drug with high thermostability.
Benzer Tezler
- Thermastabilization of cellulases by cross-linking
Çapraz bağlama ile selülaz ısıl dayanıklılığının arttırılması
JÜLİDE BİLEN
Yüksek Lisans
İngilizce
1997
Gıda MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. UFUK BAKIR
- Çörekotu lipaz enziminin (nigella sativa L.) stabilizasyonuna PEG bileşiklerinin etkisi
Stabilization of lipase from ginella sativa seeds by polyethylene glycols
ŞEHNAZ ÜNSAL
Yüksek Lisans
Türkçe
1999
Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLDEN ÜSTÜN
- Çörekotu (Nigella sativa l.) lipaz enziminin stabilizasyonuna şekerlerin etkisi
Başlık çevirisi yok
AYSUN AKIN
Yüksek Lisans
Türkçe
1998
Kimya Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜLDEM ÜSTÜN
- Bacillus clausii GMBAE 42'den saflaştırılan alkalen proteazın termal inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu2+ iyonları varlığında termostabilizasyonu
Determination of inactivation kinetics of alkaline protease purified from Bacillus clausii GMBAE 42 and its thermostabilization by Cu2+ ions
NURÇİN ÇELİK
- Shelf life improvement and quality retention of shell-eggs
Sofralık yumurtalarda raf ömrünün uzatılması ve kalitenin korunması
HÜLYA DOĞAN(KAHRAMAN)
Yüksek Lisans
İngilizce
1993
Gıda MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. LEVENT BAYINDIRLI