Molecular cloning, sequencing and transcriptional analyses of c5 pathway genes of 5-aminolevulinic acid synthesis in rhodobacter sphaeroides o.u.001
Rhodobacter sphaeroides o.u.001'de c5 5-aminolevulinik asit sentez yolunda bulunan genlerin klonlanması, dizilenmesi ve transkripsiyonel analizleri
- Tez No: 453528
- Danışmanlar: PROF. DR. GIYASETTİN KAŞIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Selçuk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 56
Özet
5-aminolevulinik asit (5-ALA), porfirin, vitamin B12 ve klorofil sentezinde bir öncü madde olarak kullanılır. 5-ALA, tarım, ilaç ve biyo-teknolojinin birçok alanında kullanılan yüksek katma değerli bir maddedir. 5-ALA'nın kimyasal sentezi birçok kompleks basamağın varlığı nedeniyle oldukça pahalıdır, ancak Rhodobacter sphaeroides gibi bazı fotosentetik bakteriler daha düşük maliyetle 5-ALA sentezleyebilirler. 5-ALA sentezi canlılarda iki farklı yoldan meydana gelir: (1) Succinyl-CoA ve glisin (Shemin yolu, C-4 yolu) ve (2) glutamat (C-5 yolu). R. sphaeroides C-4 yolu ile 5-ALA sentezlemesine rağmen, C-5 yolunun birinci ve üçüncü enzimleri ve genlerine sahiptir. C-4 ve C-5 metabolik yollarının genleri ve enzimleri dikkate alındığında, birçok farklılık veya varyasyon ortaya çıkar. Bu durum, R. sphaeroides'in genomik karmaşıklığı olarak belirtilmiştir. Benzer şekilde, C-5 5-ALA sentez yolunda glutamil tRNA sintaz, glutamil tRNA redüktaz ve GSA aminotransferaz genlerinde de farklılıklar olduğu öngörülmektedir. Bu durumu kısmen R. sphaeroides'de çözmek için, Rhodobacter sphaeroides O.U.001'deki glutamat-1 semialdehit aminotransferaz (GSA aminotransferaz) ve glutamil tRNA sintaz genlerinin moleküler klonlama, sıralama analizi ve transkripsiyonel analizleri gerçekleştirildi. Bu şekilde, C-5 5-ALA sentez yolunda bulunan genlerin zinciri tespit edildi. Bunun için, yukarı akış ve aşağı akış sekanslarının çevrelediği GSA aminotransferaz ve glutamil tRNA sentaz genleri, polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) primer çiftleri kullanılarak güçlendirildi. (Sol: 5'-GATCGAGATCGGCAGGTG-3 ve Sağ; 5 '-ACTATGTGGCGTGATGG-3) ikinci gen kullanılmıştır (Sol; 5`CGTCGATGTAGGTGATGGTG`3 ve Sağ; 5`ATCCCGATTCCGAGAAACAC`3). Primerler, R.sphaeroides 17025'in GSA aminotransferaz ve glutamil tRNA sintaz gen dizisi kullanılarak Primer3 yazılımı kullanılarak tasarlandı. PCR, R. sphaeroides O.U. 001 gDNA şablonu ve PHUSION DNA polimeraz enzimi kullanılarak yapıldı. PCR gerçekleştirildiğinde, 1912 bp PCR ürünü başarıyla elde edildi. PCR ürünü dizilime gönderildi ve GSA aminotransferaz ve glutamil tRNA sintaz genlerinin tüm dizisini elde etmek için Yeni Nesil Sıralama (NGS) uygulandı. Ulusal Biyoteknoloji Enformasyon Merkezi (NCBI) homoloji / patlama araştırmasından sonra, elde edilen R. sphaeroides O.U.001'in GSA aminotransferaz geninin sırası, GSA aminotransferaz'ınkine % 99.8 benzer bulundu. R. sphaeroides geni R.saferoides O.U.001'in 17025 GTS geninin homoloji / patlama araştırmasından sonra benzer şekilde % 99.1 olduğu bulundu. Onay üzerine, pBluescript SK (+) klonlama vektörü EcoRV ile kesildi ve GSA aminotransferazglutamil tRNA sentaz genleri bu bölgeye klonlandı. Escherichia coli XL1 Mavi'ye dönüştürüldükten sonra, rekombinant klonlar mavi / beyaz tarama ile seçildi ve kısıtlama enzimi sindirimi ve dizi (sekans) analizi ile teyit edildi. Rekombinant klonların gliserol stoğu, gelecek kullanımlar için -80ºC'de saklandı. Fotosentetik genler anaerobik ve aerobik koşullar altında ifade edilir. Benzer şekilde, glutamil-tRNA sentaz ve glutamat-1-semialdehit aminotransferaz genleri esas olarak anaerobik koşullar altında sunulur.
Özet (Çeviri)
5-aminolevulinic acid (5-ALA) is used as a precursor substance in the synthesis of porphyrin, vitamin B12 and chlorophyll. 5-ALA is a high value added substance used in many areas in agriculture, medicine, and biotechnology. The chemical synthesis of 5-ALA is quite expensive due to the presence of many complex steps but some photosynthetic bacteria like Rhodobacter sphaeroides can synthesize 5-ALA at lower cost. The synthesis of 5-ALA occurs in two different ways in living things: (1) Succinyl-CoA and glycine (Shemin pathway, C-4 pathway) and (2) using glutamate (C-5 pathway). Although R. sphaeroides synthesize 5-ALA through C-4 pathway, it has the first and the third enzymes and genes of the C-5 pathway. When the genes and enzymes of the C-4 and C-5 metabolic pathways are taken into account, there occur many variations or differences. This situation was stated as genomic complexity of R. sphaeroides. Similarly, it is foreseen that there are also differences in terms of glutamyl tRNA synthase, glutamyl tRNA reductase and GSA aminotransferase genes in C-5 5-ALA synthesis pathway. In order to solve this situation partly in R. sphaeroides, molecular cloning, sequencing and transcriptional analysis of glutamate-1 semialdehyde aminotransferase (GSA aminotransferase) and glutamyl tRNA synthase genes in Rhodobacter sphaeroides O.U.001 was performed. In this way, two of the genes present in the C-5 5-ALA synthesis pathway was identified. For this, GSA aminotransferase and glutamyl tRNA synthase genes flanked by upstream and downstream sequences was amplified in Polymerase Chain Reaction (PCR) using the primer pairs (Left: 5`-GATCGAGATCGGCAGGTG-`3 and Right; 5`- GACTATGTGGGCGTGATGG-`3) the second gene has been used (Left;5`CGTCGATGTAGGTGATGGTG`3 and Right;5`ATCCCGATTCCGAGAAACAC`3). The primers were designed using Primer3 software using the GSA aminotransferase and glutamyl tRNA synthase genes sequence of R. sphaeroides 17025. The PCR was done using R. sphaeroides O.U. 001 gDNA as a template and PHUSION DNA polymerase enzyme. Up on performing PCR, 1912 bp 1940bp PCR product was successfully obtained. The PCR product was sent to sequencing, and Next Generation Sequencing (NGS) was applied to obtain whole sequence of GSA aminotransferase and glutamyl tRNA synthase genes. After homology/blast search at National Center for Biotechnology Information (NCBI), the obtained sequence of GSA aminotransferase gene of R. sphaeroides O.U.001 was found to be 99.8% similar to that of GSA aminotransferase gene of R. sphaeroides 17025 GTS gene of R. sphaeroides O.U.001 was found to be 99.1% also similar after homology/blast search. Upon confirmation, pBluescript SK (+) cloning vector was cut with EcoRV and the GSA aminotransferase, glutamyl tRNA synthase genes were cloned to this site. After transformation into Escherichia coli XL1 Blue, the recombinant clones were selected by blue/white screening and confirmed by restriction enzyme digestion and sequence analysis. The glycerol stocks of recombinant clones were stored at -80ºC for future uses. Photosynthetic genes are expressed under aerobic and anaerobic condition. Similarly, glutamyl-tRNA synthase and glutamate-1-semialdehyde aminotransferase genes were mainly expressed under anaerobic conditions.
Benzer Tezler
- Molecular cloning, sequencing and transcriptional analyses of the genes coding for 5-aminolevulinic acid synthase isoenzymes in Rhodobacter sphaeroides O.U.001
Rhodobacter sphaeroıdes O.U.001'de bulunan 5-aminolevulinik asit sentaz izoenzimlerini kodlayan genlerin klonlanması, dizilenmesi ve transkipsiyonel analizleri
MARWA HASSAN JAWAD JAWAD
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
BiyolojiSelçuk ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GIYASETTİN KAŞIK
- Türkiye turunçgil alanlarındaki tristeza virüs izolatlarının kılıf protein genlerinin klonlaması, dna diziliminin belirlenmesi ve analizi
Molecular cloning, sequencing and analysis of the coat protein genes of citrus tristeza virus isolates from different citrus growing regions of Turkey
GÖZDE ERKIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
ZiraatSüleyman Demirel ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BAYRAM ÇEVİK
- TTH polimeraz enziminin tıbbi moleküler tanı kitlerinde kullanım amaçlı rekombinant üretimi
Expression of recombinant TTH polymerase enzyme for development of medical molecular diagnostic kits
HÜMEYRA AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyomühendislikGaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSA GÖKÇE
- Zeytin (Olea europaea) EST'leri (expressed sequence tags) koleksiyonundan seçilen lipid transfer geninin moleküler analizi
Molecular analysis of lipid transfer gene selected from olive (Olea europaea) ESTs (expressed sequence tags) collection
DİLEK ÇAĞLAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NEHİR ÖZDEMİR ÖZGENTÜRK
- Yüksek tuz toleransına sahip fasulye genotipinde tolerans ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi
Determi̇nati̇on of transcri̇pti̇on factors related to tolerances i̇n bean genotype wi̇th hi̇gh salt tolerances
GÖKHAN GÖKDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSA KAVAS