Investigation of the interactions between NFIB and potential binding partners MAD2B and ATXN3
NFIB proteininin potansiyel bağlanma partnerleri olan ATXN3 ve MAD2B ile etkileşiminin araştırılması
- Tez No: 458859
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 131
Özet
Nükleer Faktör I (NFI) ailesi, DNA'da spesifik bölgelere bağlanan bir protein ailesidir. Bu proteinler, viral DNA replikasyonunda ve transkripsiyonel regülasyonda rol oynarlar. NFI transkripsiyon faktörü ailesi embriyonun gelişimi boyunca ve yetişkin kök hücre nişlerinde gen regülasyonunda görev almaktadır. DNA-bağlanma analizi deneyleri ile NFI proteinlerinin DNA üzerinde çift simetrik korunmuş bir dizi bölgesine bağlandığı ortaya çıkarılmıştır. Bu çift simetrik dizi, çift zincirli DNA üzerinde TTGGC(N5)GCCAA sekansı olarak bulunmaktadır. NFI proteinleri bu korunmuş bağlanma bölgesine homo ya da heterodimer olarak yüksek afinite ile bağlanmaktadır. Dört NFI geni, NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX, Xenopus türünden insan'a kadar incelenen bütün omurgalılarda tanımlanmıştır. NFI ailesinin üyesi olan tüm proteinler, N ucunda DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi ve C ucunda transkripsiyonel aktivasyon ve represyon bölgesi içermektedirler. N ucunda bulunan DNA bağlanma/dimerizasyon bölgesi, NFI genleri arasında güçlü bir şekilde korunmuş bir bölgedir. Bu bölge 200-220 amino asit bir uzunluğundadır. Bu bölgede bulunan 4 adet sistein tüm NFI DNA bağlanma bölgeleri arasında korunmuştur. Ancak bu DNA bağlanma bölgesi heliks-turn-heliks gibi diğer sınıf iyi tanımlanmış DNA bağlanma motifleri ile bir benzerlik göstermemektedir. Ek olarak, bu korunmuş bölge TGF-β sinyal yolağında görevli SMAD proteininde de bulunan MH1 motifini içermektedir. Buna karşılık, prolin bakımından zengin olan C ucu bölgesi, N ucu bölgesi ile karşılaştırıldığında daha az korunmuştur. Ayrıca, NFI proteinlerinde çeşitlilikler daha çok C ucu alanında oluşmaktadır. Bu proteinler büyük olasılıkla farklı transkripsiyon modülasyon alanlarını kodluyorlar. NFI transkripsiyon faktörlerinin gen anlatım örüntüsü hücre tipine göre değişmektedir. NFI transkripsiyon faktörleri, memeli gelişimi esnasında dokuya özel gen anlatımında önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, merkezi sinir sisteminde gen anlatımları ile kök hücrelerin farklılaşmasını kontrol etmektedir. NFI transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin promotorlarına bağlanarak ifadelerinin aktivasyonuna ya da baskılanmasına yol açabilmektedirler. Literatürde, protein-protein etkileşimlerini keşfetmek için kullanılan maya ikili hibrit sistemi ya da Y2H yöntemi ile NFI faktörlerinin histonlar ile etkileştiği gösterilmiştir. Ayrıca bu etkileşim transfekte edilen memeli hücre deneyleri ile doğrulanmıştır. Daha sonra maya iki ikili hibrit sistemi ile bir insan fetal beyin cDNA kütüphanesi taranmıştır. Tarama esnasında NFIB yem olarak kullanılmıştır. Bu tarama sonucunda yem olarak kullanılan NFIB ile güçlü bağlanma gösteren proteinler tanımlamıştır. Potansiyel partnerler arasından olası etkileşimlerin araştırılması için ATXN3 ve MAD2B proteinleri seçilmiştir. ATXN3 proteini, poliglutamin protein ailesinin bir üyesidir ve bu protein ailesi dokuz farklı nörodejeneratif genetik hastalık ile ilişkilendirilmiştir. ATXN3 proteini genel olarak sitoplazmik bir proteindir. Yaygın bir biçimde nöral ve nöral olmayan insan dokularında ifade edilmektedir. ATXN3 gen anlatımının seviyesi insan beyninin farklı kısımlarında çeşitlilik göstermektedir. İnsan beyninde ATXN3 gen anlatımı, spesifik nöron alt popülasyonlarında gözlenmiştir. Ayrıca, ATXN3 proteininin ubikuitin- proteazom sistemi ilişkisi ve transkripsiyon düzenlenmesinde rol oynadığı ve etkisi gösterilmiştir. MAD2B bir insan genidir ve MAD2L2 ve Rev7 olarak da adlandırılır. Bu protein, spindle checkpoint geni olarak adlandırlan MAD2 ile homologdur. İnsan MAD2B proteini, MAD2 (mitotic arrest deficient 2) proteini ile amino asid dizisi bakımından %53 oranında benzerlik göstermektedir. MAD2B, hücre döngüsünde spindle assembly checkpoint (SAC) olarak adlandırılan kontrol noktaları için önemli bir aracıdır. MAD2B proteini birçok hücresel fonksiyonlarda da yer almaktadır. Bu fonksiyonlardan biri olan hücre döngüsü regülasyonunda, Cdc20/Cdh1 proteinlerinde bağlanarak anafaza geçiş kompleksini (APC) durdurduğu gösterilmiştir. Bu protein, memeli hücrelerde DNA hasar yanıtında da önemli bir işleve sahiptir. Ek olarak, MAD2B proteini yapısal ve fonksiyonel olarak HORMA bölgesini taşımaktadır. ATXN3 ve MAD2B transkripsiyonel regülasyon özellikleri ile gelişimsel süreci düzenlemektedirler. ATXN3 ve MAD2B proteinlerinin yokluğunda anormal beyin gelişimi ve hücre oluşumu bozukluklarına yol açmaktadır. Ayrıca ATXN3 ve MAD2B mutant (-/-) farelerde fenotip incelendiğinde her iki proteinin de embriyonik gelişimde rol aldığı gözlenmiştir. MAD2B geninin susturulduğu farelerde, embriyolarında primordiyal eşey hücrelerinin (PGCs) farklılaştıktan sonra kaybolduğu ve epigenetik programlamanın sürdürülemediği gözlenmiştir. ATXN3 ise, deubikitinasyon aktivitesi nedeniyle sinir sisteminde önemlidir. ATXN3 mutant (-/-) farelerde yapılan çalışmalarda nöronal işlev bozuklukları ve nörodejenerasyon gözlenmiştir. Bu çalışmada NFIB ile ATXN3 ve MAD2B etkileşimini gösterebilmek için, birlikte immünçöktürme ve GST ile çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. Bu deneylerin sonucunda, epitop etiketli MAD2B, ATXN3 ve NFI proteinleri birlikte ifade artırımı yapıldıktan sonra proteinlern bağlanmaları birlikte çöktürme deneyi ile analiz edilmiştir. İmmünçöktürme deneylerinin sonucunda, MAD2B ve NFIB proteinlerinin birlikte çöktüğünü gözlemledik. İki proteinin de karşılıklı olarak birbirlerini çöktürdüğünü de gösterdik. Diğer NFI proteinleri, NFIA, NFIC ve NFIX proteinlerinin MAD2B ile birlikte çökmediği yani bir etkileşimin olmadığını gözlemledik. Bu deneylere ek olarak, mutant NFIB proteinleri ile birlikte çöktürme deneyini gerçekleştirdik. Deneyde kullanılan NFIB dominant negative mutant proteinleri ya yalnızca N-ucu DNA bağlanma dimerizasyon bölgesini (NFIB_N) ya da C-ucu transkripsiyon aktivasyon ve baskılama bölgesini içermektedir (NFIB_C). Bu deneylerde mutant NFIB proteinlerinin her ikisinin de MAD2B protein ile birlikte çöktüğü gözlenmemiştir. Diğer yandan, GST-ATXN3 füzyon proteininin ve NFI proteinleri birlikte çöktürme deneylerini gerçekleştirdik. GST çöktürme deneyleri sonucunda GST-ATXN3 proteinin hem NFIA hem de NFIB proteinini çektiği gözlenmiştir. Hangi NFIB bölgesinin bağlanmada etkili olduğunu gözlemlemek amacıyla, immünçöktürme deneyinde de kullanılan NFIB dominant negative mutant proteinlerinin GST-ATXN3 ile etkileşimi ölçülmüştür. Deney sonucunda hem NFIB_N, hem de N terminal bölge ile Engrailed represör bölgesini içeren NFIB_Eng füzyon proteinin (NFIB_E), GST etiketli NFIB protein ile birlikte çöktüğü gözlenmiştir. Sadece C ucu içeren mutant NFIB, GST-ATXN3 ile birlikte çökmemiştir. Bu nedenle, yalnızca C ucunun ATXN3 ile etkileşim için yeterli olmadığı sonucunu çıkarmaktayız. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, NFIB proteinin farklı etkileşim partnerleri tarafından regülasyonu ve dolyısıyla NFI ailesinin nöral gelişimdeki rolünü aydınlatmaya katkıda bulunacaktır.
Özet (Çeviri)
Nuclear Factor I (NFI) family of transcription factors are site-specific DNA-binding proteins that play roles in viral DNA replication and regulation of gene expression. NFI proteins bind with high affinity to the dyad symmetric consensus sequence TTGGC(N5)GCCAA on duplex DNA as homo or heterodimers. Four NFI genes (NFIA, NFIB, NFIC and NFIX) have been identified in every studied vertebrate species from Xenopus to human. NFIs contain an N-terminal DNA binding and dimerization domain and a C-terminal transcriptional activation and repression domain. The N-terminal DNA-binding/dimerization domain (DBD) is highly conserved between the four genes and includes an MH1 motif also found in SMAD proteins of the TGF-β signaling pathway. In contrast, the proline rich C-terminal domain is less conserved. Furthermore, C-terminal domain, which encodes the transcription modulation domain, varies among the NFI family members. NFI transcription factors are expressed in a cell-type specific fashion and may regulate tissue-specific gene expression during mammalian development. NFIA, NFIB, and NFIX are expressed in the ventricular zones in the developing nervous system, and in the adult neural stem cell niches. NFIs can both activate and repress transcription. Previously, a yeast two hybrid screen of a fetal human brain cDNA library using NFIB as bait identified ATXN3 and MAD2B as potential NFIB binding partners. ATXN3 belongs to the family of polyglutamine proteins which are implicated in nine different genetic neurodegenerative disorders. ATXN3 is generally a cytoplasmic protein, widely expressed in neural and non-neural human tissues. ATXN3 has been associated with the ubiquitin–proteasome system as well as transcriptional regulation. MAD2B is also known as MAD2L2 and Rev7 and is homologous to the spindle checkpoint gene MAD2. MAD2B is an important intermediary of the spindle assembly checkpoint. MAD2B is also involved in cell cycle regulation where it was shown to inhibit the Anaphase Promoting Complex (APC) by binding to Cdc20/Cdh1. MAD2B also acts in the DNA damage response in mammalian cells. Moreover, this protein carries the HORMA domain, responsible for protein-protein interactions. Both proteins can regulate developmental processes by transcriptional regulation. In mice that are deficient in MAD2B, primordial germ cells (PGCs) die after being specified due to misregulation of epigenetic reprogramming. Deubiquitinating activity of ATXN3 is critical for the nervous system. ATXN3 null mice exhibit neuronal dysfunction and neurodegeneration. In this study, in order to explore interactions between NFIB and ATXN3 or MAD2B, we performed co-immunoprecipitation experiments and GST pull down assays. To this end, epitope tagged MAD2B, ATXN3 and NFIs were overexpressed in HEK293T cells and binding was assessed via co-immunoprecipitation. We found that MAD2B and NFIB could be co-immunoprecipitated with each other. Other NFI family members (NFIA, NFIC, NFIX) did not appear to bind MAD2B. In addition, we also tested for binding of several mutant NFIB constructs that comprise only the NFIB N-terminal DNA binding and dimerization domain (NFIB_N) or C-terminal transactivation-repression domain (NFIB_C) to MAD2B. Both mutant NFIB proteins could not precipitate with MAD2B. On the other hand, ATXN3 did not co-immunoprecipitate with NFIB and NFIB did not co-immunoprecipitate with ATXN3. Furthermore, we analyzed binding of these proteins using an alternative approach, the Glutathione-S transferase (GST) pull down assay. GST pulldown experiments with NFIs and ATXN3 showed that ATXN3 pulled down NFIA and NFIB. To find out which NFIB domains are required for ATXN3 binding, we performed GST pulldown experiments using mutant NFIB proteins. Once again, these mutant constructs were NFIB_C, NFIB_N and finally, NFIB_E which encodes for NFIB DBD-engrailed repressor fusion protein. Preliminary data indicate that GST-ATXN3 precipitated NFI_N and NFIB_E but not NFIB_C. We, therefore, surmised that NFIB may interact with ATXN3 through its N terminal domain in these experiments. Further experiments that examine these interactions in vivo are required to verify these results. NFIB and binding partner domains that are involved in these putative interactions, can then be dissected by site-directed mutagenesis. In conclusion, the results obtained from this study will help elucidate the regulation of NFIB by various interaction partners, which in turn will help uncover the role of NFI family in neural development.
Benzer Tezler
- Investigation of the interaction between NFI and its potential interaction partner BRG1
NFI proteininin potansiyel etkileşim partneri olan BRG1 ile etkileşiminin araştırılması
SELİM TÜRKEL
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- In vitro and in silico investigation of NFIB-SUMO interactions
NFIB-SUMO etkileşimlerinin in vitro ve in silico olarak incelenmesi
AYBERK ÖZKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- In vitro investigation of the interactions of nuclear factor one proteins with transcriptional regulators PIN1 and LMO4
Nükleer faktor ı proteinlerinin transkripsiyonel ragülatörler PIN1 ve LMO4 ile etkileşimlerinin in vitro olarak araştırılması
SİNEM SARITAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Investigation of the interactions between cancer cells and the microenvironment at the cellular level
Kanser hücreleri ile mikroçevre arasındaki etkileşimlerin hücresel seviyede incelenmesi
EYÜP YÖNDEM
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DEVRİM PESEN OKVUR
- Su kaynaklarında bulunan seçilmiş kirletici moleküllerin biyolojik moleküllerle etkileşiminin moleküller modelleme yoluyla incelenmesi
Investigation of the interactions between selected contaminators in water resources and biological molecules by molecular modeling
CEMAL KÖPRÜLÜOĞLU
