In vitro and in silico investigation of NFIB-SUMO interactions
NFIB-SUMO etkileşimlerinin in vitro ve in silico olarak incelenmesi
- Tez No: 718174
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 137
Özet
Nükleer Faktör I transkripsiyon faktörü ailesi, nöronal terminal farklılaşması, gliogenez, kök hücre sessizliği ve ayrıca tümörigenez ve kanser ilerlemesi gibi patolojiler dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol oynar. NFI ailesi dört gen tarafından kodlanır: NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX. NFI proteinleri, yüksek oranda korunmuş bir N-terminal DNA bağlama ve dimerizasyon bölgesi içerirken, C-terminal bölgeleri birbirinden farklıdır. Yüksek derecede benzer DNA bağlama ve dimerizasyon bölgeleri nedeniyle, NFI proteinleri, in vitro olarak benzer afinite ile palindromik bir konsensus bölgesine bağlanır ve in vivo koşullarda potansiyel olarak aynı hedef genleri düzenler. NFI aile üyeleri arasındaki fonksiyonel farklılık, transkripsiyonel aktivasyon ya da baskılama görevi olan C-terminal bölgelerinden kaynaklanabilir. NFI proteinlerinin tarafından hedef gen ekspresyonu düzenlemesi, farklı etki mekanizmalarıyla meydana gelebilir. NFI proteini doğrudan DNA'ya bağlanabilir ve hedef genin ekspresyonunu düzenleyebilir veya NFI proteini, gen ekspresyonunu dolaylı olarak etkilemek için başka bir protein ile etkileşime girebilir. Bu mekanizmalar dahilinde; NFI proteinleri histon proteinleri ile etkileşime girebilir ve nükleozom yapısında değişikliklere neden olabilir, böylece transkripsiyon kompleksinin oluşumunu etkileyebilir; bazal transkripsiyon faktörleriyle doğrudan etkileşime girebilir ve transkripsiyona etki edebilir; transkripsiyonel aktivasyonu düzenlemek için ko-aktivatör veya ko-represörler ile etkileşime girebilir; ortak hedef gen ekspresyonunun düzenlenmesi için diğer transkripsiyon faktörleriyle birlikte düzenlemeye dahil olabilir; DNA metiltransferazların promotor bölgesinden ayrılmasına neden olarak transkripsiyonu aktive edebilir. NFI proteinlerinin üretim veya etki mekanizmalarındaki herhangi bir değişiklik, gelişimsel bozuklulara ve kansere yol açmaktadır. NFI ailesinin bir üyesi olan NFIB, fareler üzerinde yapılan gen nakavt çalışmalarında gösterildiği gibi önemli bir gendir: NFIB geninin susturulması, akciğer bozuklukları nedeniyle perinatal ölüme yol açar. NFIB, adiposit, megakaryosit, melanosit ve hipokampal nöral progenitörler gibi farklı hücre tiplerinde kök hücre farklılaşmasını kontrol eder. İlginç bir şekilde, insanlarda, NFIB geninin bir kopyasının mutasyonu, zihinsel engele ve beyin malformasyonlarına neden olabilir. Bu bulgular, bir transkripsiyonel regülatör olan NFIB proteininin önemini vurgulamaktadır, ancak NFIB proteini aktivitesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak açıklanamamıştır. Ayrıca NFI proteinleri ile ilgili post-translasyonel modifikasyonlar açısından yeterli veri de mevcut değildir. Fosforilasyon, glikosilasyon, asetilasyon, sumolasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar, NFI proteinlerinin aktivitesini regüle edebilir ve bu regülasyon hedef gen transkripsiyonları üzerinde etkiye sahip olabilir. Bu modifikasyonlar içerisinde sumolasyon, ökaryotik organizmalar tarafından korunmuştur ve nükleer taşıma, kromozom segregasyonu ve transkripsiyon aktivasyonu/baskılaması gibi birçok hücresel mekanizmayı düzenleyebilir. Genellikle transkripsiyonel regülasyon mekanizmalarında baskılayıcı olarak saptanan SUMO (small ubiquitinlike modifiers), birçok transkripsiyon faktörüne konjuge olabilmekte ve bu faktörlerin aktivitelerini etkileyebilmektedir. SUMO gen ailesinin memelilerde 5 izoformu bulunmaktadır: SUMO1, SUMO2, SUMO3, SUMO4 ve SUMO5. SUMO peptidleri bir dizi enzimatik işlemle aktive edilir. Bu işlemler, aktif olan ve hedef proteine spesifik olarak bağlanabilen matur SUMO'yu oluşturmak için gereklidir. Hedef proteinler üzerindeki sumolasyon konsensus bağlanma bölgeleri ve SUMO etkileşim motifleri (SIM: SUMO interacting motif), SUMO'nun bu proteinleri spesifik olarak tanımasını ve bağlanıp aktivitelerini regüle etmesini sağlar. Sumolasyon, transkripsiyon faktörlerini birçok yönden etkileyebilir. SUMO, transkripsiyon faktörlerine konjüge olmak için diğer modifikasyonlarla rekabet edebilir, ko-aktivatörlerle etkileşime girebilir ve kromatin üzerinde hedef bölgesine bağlanacak transkripsiyon faktörünün bağlanmasını kontrol edebilir. Ek olarak, sumolasyon, transkripsiyon faktörlerinin hücre içi lokalizasyonunu kontrol edebilir. In vitro çalışmalarda NFI sumolasyonu gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, bir çalışmada, oksidatif strese maruz bırakılan nöroblastoma hücrelerinden izole edilen sumolanmış proteinler arasında, NFIB proteini için 1 sumolasyon konsensus bölgesi tahmin edilmiştir. Bununla birlikte, NFI sumolasyonu in silico ve hücre kültüründe daha detaylı incelenmemiştir. Bu çalışmada, NFIB SUMO konsensus bağlanma bölgesi ve SIM bölgeleri işlevselliği in silico metodlar ve hücre kültürü çalışmalarıyla araştırılmıştır. Şimdiye kadar NFI proteinlerinin deneysel ve modellenmiş 3 boyutlu yapısı bulunmamaktadır. NFI proteinlerinin yapısı hakkındaki bilgiler sınırlıdır. Belirtildiği gibi, bu proteinler N-terminal DNA bağlama ve dimerizasyon ve C-terminal transaktivasyon bölgeleri içermektedirler. Ayrıca NFI proteinlerinin DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesinde dört sistein amino asidi korunmuştur, dört sistein amino asidinden üçü DNA bağlama aktivitesinin gerçekleşebilmesi için oldukça önemlidir. NFI proteinlerinin yapısı hakkında bir başka bilgi, SMAD3 proteininin MH1 bölgesi ile NFI proteinleri arasındaki homoloji ile ilgilidir. Bu homoloji, SMAD3 proteininin MH1 bölgesi ve NFI proteinlerinin DNA bağlama-dimerizasyon bölgesinin, 3 sistein amino asidi ve 1 histidin amino asidinden oluşan oldukça benzer Cys-His kutu motifine sahip olduklarını gösterir. Bahsedilen homoloji %30'un altındadır. Bu çalışmada, yüksek homoloji ve katlanma benzerliği olmaması nedeniyle, ab initio modelleme yöntemi kullanılarak NFIB'nin DNA bağlanma ve dimerizasyon bölgesi tahmin edilmiştir. Daha sonra bu tahminler validasyon yöntemleriyle birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma için; DNA bağlama aktivitesi için gerekli olan sistein amino asitleri ve ayrıca korunmuş MH1 Cys-His kutusu ana odak noktalarıydı. Daha sonra seçilen yapı tahmin modelleri, moleküler dinamik simülasyonlarıyla değerlendirilmiş ve son olarak REMD (Replica Exchange Molecular Dynamics) simülasyonları ile daha yüksek stabilite ve kalite gösteren model doğrulanmıştır. NFIB SIM ve SUMO1 etkileşimleri moleküler docking simülasyonlarıyla araştırılmıştır. Sonuç olarak SUMO1 özellikle bir NFIB SIM bölgesi ile etkileşmektedir. Ayrıca, bu sırada NFIB-SUMO1 konjügasyonu in vitro metodlarla araştırılmıştır. Bu yöntemler dahilinde bölgeye özgü mutagenez ile sumolasyon konsensus bölgesi ve SIM bögelerinden bir tanesi mutasyona uğratılmıştır. NFIB ve SUMO1, ayrıca NFIB mutantları ve SUMO1, HEK293T hücrelerinde ko-transfekte edilmiş ve sonrasında NFIB immünopresipitasyonu ile NFIB-SUMO1 konjügasyonu incelenmiştir. Potansiyel NFIB sumolasyon konsensus bölgesi ve SUMO etkileşim motiflerinin doğruluğunun araştırılması için gelecekteki hücre kültürü deneyleri gereklidir.
Özet (Çeviri)
Nuclear Factor I family of transcription factors are involved in regulation in diverse physiological processes, including neuronal terminal differentiation, gliogenesis, stem cell quiescence as well as in pathologies such as tumorigenesis and cancer progression. NFI family is encoded by four genes: NFIA, NFIB, NFIC and NFIX. NFI proteins contain a highly conserved N-terminal DNA binding and dimerization domain, while their C-terminal domains diverge. Because of their highly similar DNA binding and dimerization domain, NFIs bind to a palindromic consensus site with similar affinity in vitro, potentially regulating the same set of target genes in vivo. Any functional differences between the family members may arise from the more diverse C-terminal domain provides which can promote either transcriptional activation or repression. NFIs may regulate target gene expression via different mechanisms of action. NFI can bind directly to DNA and regulate the expression of the target gene or interact with another protein to affect gene expression indirectly. Moreover, NFIs can interact with histone proteins and cause alterations in the nucleosome structure, thereby being involved in the formation of the transcription complex. NFIs can directly interact with and facilitate recruitment of basal transcription factors. NFIs can also bind co-activator or co-repressors to control transcriptional activation. In addition, NFIs can, along with other transcription factors, co-regulate target gene expression. Finally, NFIs can promote dissociation of DNA methyltransferase from target gene promoters and activate transcription. Any alterations in the production or action mechanisms of NFI proteins lead to important developmental defects as well as cancer. One member of the NFI family, NFIB, is an essential gene as demonstrated by studies on knockout on mice: silencing of NFIB leads to perinatal death due to lung defects. NFIB controls stem cell differentiation in different cell types such as, adipocytes, megakaryocytes, melanocytes and hippocampal neural progenitors. Interestingly, in humans, mutation of one copy of the NFIB gene can result in intellectual disability and brain malformations. These findings underscore the importance of NFIB as a transcriptional regulator, however, the mechanism by which NFIB acts or regulatory events upstream of NFIB have not been fully elucidated. Indeed, scarce data exists regarding NFI post-translational modifications. Phosphorylation, glycosylation, acetylation, sumoylation may regulate the activity of NFI. Among these modifications, sumoylation is conserved by eukaryotic organisms. Sumoylation regulates many cellular mechanisms such as nuclear transport, chromosome segregation, and transcription activation/repression. SUMO (small ubiquitin like modifiers), which is generally observed as a suppressor in transcriptional regulation, can be conjugated to many transcription factors and affects the activity of these factors. The SUMO gene family has five mammalian isoforms: SUMO1, SUMO2, SUMO3, SUMO4 and SUMO5. SUMO peptides are activated by a series of enzymatic processes. These processes are required to form mature SUMO, which is active and may able to conjugate specifically to the target protein. The sumoylation consensus sites and SIM (SUMO interacting motif) on target proteins enable SUMO to specifically recognize and bind to these proteins and regulate their activities. Sumoylation can affect transcription factors in several ways. SUMO can compete with other modifications, may interact with co-activators, and can control the binding of the transcription factor to its target site on chromatin. In addition, sumoylation can control intracellular localization of transcription factors. Sumoylation of NFI has been shown in vitro. Interestingly, a study on neuroblastoma cells exposed to oxidative stress, identified NFIB among sumoylated proteins modified on sumoylation consensus sites. However, sumoylation of NFIs have not been further explored, in silico and in cell culture. In this study, we set out to investigate the functionality of sumoylation consensus site and SUMO interacting motifs of NFIB, using in silico methods and forced expression in cell culture. Currently, there is no experimental or modeled 3D structure of NFI proteins. Information about NFI protein structure is quite limited. As mentioned above, NFI proteins contain an N-terminal DNA binding and dimerization domain and C-terminal transactivation domain. NFI proteins carry four conserved cysteine residues in their DNA binding and dimerization domains, three of which are required for DNA binding activity. Another piece of evidence regarding NFI structure comes from the homology with the MH1 domain of SMAD3. Both proteins have highly similar Cys-His box motifs consisting of three cysteine residues and one histidine residue. Nevertheless, this homology is below 30%. Here, due to the lack of high homology and also fold similarity, we used ab initio modeling method to predict structure of NFIB DNA binding and dimerization domain. Subsequently, these predictions were compared to each other. For this comparison, we focused on the cysteine residues which are required for DNA binding activity as well as the conserved MH1 Cys-His box motif. Then, selected structure prediction models were assessed by molecular dynamic simulations. Finally, with REMD (Replica Exchange Molecular Dynamics) the model that showed higher stability and quality was verified. We performed molecular docking simulations to investigate NFIB SIM-SUMO1 interactions. We found that SUMO1 would preferentially bind to a specific NFIB SIM. Meanwhile, to investigate NFIB-SUMO1 conjugation in vitro; site-directed mutagenesis was performed for generation of a sumoylation consensus site mutant and a SIM mutant. HEK293T cells were co-transfected with SUMO1 and wild-type NFIB or NFIB mutants and NFIB was immunoprecipitated for analysis of NFIB-SUMO1 conjugation. Future experiments are required to validate the putative NFIB sumoylation consensus site and SIMs in cell culture.
Benzer Tezler
- Bazı yeni organik bileşiklerin tirosinaz ve alfa amilaz inhibisyon potansiyellerinin in vitro ve in siliko olarak incelenmesi
In vitro and in silico investigation of tyrosinase and alpha amylase inhibition potentials of some new organic compounds
BÜŞRA KURNAZ
- Bazı triazol türevlerinin klinik öneme sahip alfa amilaz ve tirosinaz inhibisyon potansiyellerinin in vitro ve in siliko olarak incelenmesi
In vitro and in silico investigation of clinically important alpha amylase and thyrosinase inhibition potentials of some triazol derivative
ELİF AYAZOĞLU DEMİR
- Azometin grubu içeren heterosiklik bileşiklerin nöroblastom hücrelerinde hücre döngüsü ve apoptoz yolağı üzerine etkisinin in vitro ve in siliko incelenmesi
In vitro and in silico investigation of the effect of heterocyclic compounds containing azomethine group on cell cycle and apoptosis pathway in neuroblastoma cells.
GÜLCİHAN ÇINAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyokimyaSivas Cumhuriyet ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YAVUZ SİLİĞ
- İzokinolin grubu bir alkaloid olan allokriptopinin oksidatif stres kaynaklı nöral hasara karşı koruyucu etkinliğinin ve ilaç etken maddesi olabilme potansiyelinin in-vitro ve in-siliko olarak araştırılması
In-vitro and in-silico investigation of the protective efficacy of allocryptopine, an isoquinoline alkaloid, against oxidative stress-induced neural damage and its potential to be a drug active ingredient
SAHRA SETENAY BARAN
- Kinazolin-triazol türevlerinin potansiyel kolinesteraz enzim inhibitör özelliklerinin in vitro ve in silico incelenmesi
In vitro and in silico investigation of potential cholinesterase enzyme inhibitory properties of quinazoline-triazole derivatives
EBRU ERDOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyokimyaKahramanmaraş Sütçü İmam ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SEYİT ALİ GÜNGÖR