Investigation of the interaction between NFI and its potential interaction partner BRG1
NFI proteininin potansiyel etkileşim partneri olan BRG1 ile etkileşiminin araştırılması
- Tez No: 496321
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Nöroloji, Biology, Genetics, Neurology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 105
Özet
Nükleer faktör I (NFI) protein ailesi transkripsiyon faktörleri belirli DNA bölgelerine bağlanarak hem viral DNA replikasyonunu hem de gen ifadesini kontrol eder. NFIA, NFIB, NFIC ve NFIX olmak üzere dört adet NFI geni bulunmaktadır ve bu genler omurgalı canlılar arasında korunmuş yapıdadır. Omurgalılarda bulunan dört adet NFI geninin gen ifadesi sırasında alternatif eşlenmesi sonucunda birçok NFI protein çeşidi üretilebilmektedir. NFI proteinleri çift zincirli DNA üzerindeki TTGGC(N5)GCCAA sekansına yüksek afinite ile, TTGGC ve GCCAA sekansına ise düşük afinite ile bağlanmaktadır. NFI protein ailesi N-ucunda DNA'ya bağlanma ve dimerizasyon bölgesini, C-ucunda ise gen ifadesini baskılama veya aktivasyon bölgelerinden oluşmaktadır. N-ucu bölgesi tüm omurgalı NFI ailesinde yaklaşık 220 amino asit içeren çok korunaklı bir yapı halindedir. Bu bölge dört adet sistein amino asidi içermektedir. Sistein amino asitlerinin üç tanesi NFI proteininin DNA'ya bağlanmasında ve dimerizasyonda rol oynamaktadır. Dört adet NFI geninin farklı olmasını sağlayan bölge NFI'in C-ucudur. C-ucunun alternatif eşlenme geçirmesi sonucunda her genden farklı NFI proteinleri üretilmektedir. Bu bölge NFI proteininin hedef gen bölgelerinin ifadesini baskılamasında veya aktifleştirmesinde görevlidir. Bu nedenle NFI, transkripsiyon faktörü olarak da bilinmektedir. NFI transkripsiyon faktörü ailesinin üç üyesi, NFIA, NFIB ve NFIX nöral gelişimde önemli roller oynamaktadır. Nfi nakavt deneylerinde hipokampüs, omurilik, pons gelişimlerinde bozukluklar meydana gelmesi NFI'in nöral gelişimde rol oynadığının göstergesidir. Sinir sistemine spesifik olan bu üç NFI proteininin ifadesi nöronlarda, astrositlerde ve oligodendrositlerde tespit edilmiştir. NFI transkripsiyon faktörleri çeşitli genler ve proteinler ile etkileşerek gen ifadesini düzenlemektedir. Arka beyinde NFIA, Sox9 ve Sox10 gibi diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşerek gliyal farklılaşmayı düzenler. NFI proteinleri ayrıca diğer kromatin düzenleyiciler ile de etkileşir: Zhao L. ve arkadaşlarının (2005) HeLa ve T lenfosit hücrelerinde yaptığı birlikte çöktürme ve kolokalizasyon deneyleri, NFI transkripsiyon faktörünün transkripsiyonu aktifleştirmek üzere BRG1'e ve RNA polimeraz II enzimine bağlandığını göstermektedir. BRG1/BRM İlişkili Faktör (BAF) kompleksi, yapısında bulunan BRG1 (Brahma İlişkili Gen 1) ATPase alt ünitesi sayesinde ATP'yi enerji kaynağı olarak kullanan ve bu sayede kromatinin yapısını değiştiren bir epigenetik faktördür. Maya SWI/SNF kompleksine benzeyen bir yapıda bulunan bu memeli kompleksi, 2 megadalton büyüklüğündedir ve en az 15 alt üniteye sahiptir. Farklı hücrelerde bulunan çeşitli alt ünite kombinasyonları, birçok farklı etkileşimde bulunabilecek sayısız BAF kompleksleri meydana getirebilir. BAF kompleksi transkripsiyon faktörleri ile etkileşime girerek hedef genleri transkripsiyona aktif veya pasif hale getirebilmektedir. Bu özelliğinden dolayı birçok gelişimsel proseslerde önemli roller oynamaktadır. Örneğin Brg1-/- farelerde embriyo gelişiminin erken safhalarında nöral tüp gelişiminde kusurlar oluşmaktadır. Brg1 ifadesinin nöral öncül hücrelerde susturulması, nöral hücrelerin kendilerini yenilemelerini engellemekte ve bu nedenle nöral hücre miktarında azalma görülmektedir. BRG1 (Brahma İlişkili Gen 1) BAF kompleksinin enzimatik alt ünitesidir. ATP'yi enerji kaynağı olarak kullanarak kromatinin yapısını değiştirir ve bu sayede hedef genin gen ifadesine açık veya kapalı hale gelmesini sağlar. Yapısında bir çok bölge bulundurur. N-ucundaki QLQ bölgesi ile proteinler ile etkileşime girer, ayrıca yine N-ucundaki HSA bölgesi ile aktin ve aktin ilişkili proteinler ile etkileşime girmektedir. N-ucunda bulunan bir başka bölge olan BRK bölgesinin görevi henüz bilinmemektedir. BRG1 proteininin orta kısmında DEXHc ve HELICc enzimatik bölgeleri bulunmaktadır. Bu bölgeler helikaz aktivitesi gösterir ve enzimatik işlemler için ATP'yi enerji kaynağı olarak kullanmaktadırlar. BRG1'nın C-ucunda ise Bromo bölgesi ve AT-hook motifi bulunmaktadır. Bromo bölgesi, BRG1'nın histon kuyrukları üzerinde bulunan asetillenmiş lizin rezidülerine bağlanmasını sağlar. AT-hook motifi ise BRG1'nın DNA'ya bağlanmasına ve asetillenmiş histon bölgelerine getirilmesine yardımcı olduğu düşünülmektedir. Hem BRG1 hem de NFI gelişim sırasında gen ifadesinin regülasyonunda yer aldığı ve nöral olmayan hücrelerde etkileştikleri gösterildiği için bu etkileşimi daha fazla araştırmak istedik. Bu etkileşimlerin nöral hücre hatlarında bulunup bulunmadığını ve NFI üyelerine spesifik olup olmadığını belirlemek için ifade arttırımı ve birlikte çöktürme deneyleri gerçekleştirdik. Bu amaçla, epitop işaretli BRG1 ve NFI proteinlerinin ifadesi HEK293T hücrelerinde arttırıldı ve etkileşimleri birlikte çöktürme deneyleri ile analiz edildi. FLAG-BRG1'in bütün HA-NFI ailesi proteinleri ile çöktüğünü gösterdik. Karşılıklı birlikte çöktürme deneyleri ile Nfib ve Nfix'in BRG1 ile çöktüğünü gösterdik. Öncül verilere göre de Nfia ve Nfic'nin BRG1 ile etkileşebileceğini düşünmekteyiz. Ek olarak, endojen NFIB ve BRG1 proteinleri zenginleştirilmiş SH-SY5Y nöroblastoma nükleer ekstraklarını kullanarak immünçöktürme deneyleri gerçekleştirdik. İlginçtir ki, NFIB bu hücre hattında diğer NFI ailesi üyelerine göre daha fazla miktarda ifade edilmektedir. Ancak endojen seviyede eksprese olan BRG1'in NFIB'yi çöktürdüğünü doğrulayamadık, kesin sonuçlar elde edebilmek için farklı primer antikorlar ve antikor kontrolleri ile çalışmalar devam etmektedir. BRG1 proteini dört farklı bölgeden oluşmaktadır. İlk bölge Prolin yönünden zengin protein-protein etkileşiminde rol oynayan, ikinci bölge fonksiyonu bilinmeyen korunaklı bir yapıya sahip, üçüncü bölge enzimatik reaksiyonlarda rol oynayan, son bölge ise BRG1'in asetillenmiş histon kuyruğuna bağlanmasını sağlayan bölgelerdir. Bu çalışmada, BRG1'in hangi bölgeleriyle NFI ile etkileştiğini de tespit etmek istedik. Rekombinasyon ile Myc işaretli BRG1 bölgeleri I ve II'yi içeren memeli ifade konstraktları üretmeye çalıştık ve Joan Massague'un laboratuvarından Myc işaretli BRG1 bölgeleri III ve IV'ü ve FLAG işaretli tüm BRG1'i içeren vektörler edindik. Ancak In-fusion klonlama ile BRG1'nın I ve II bölgelerini klonlamakta başarılı olamadık. Bu nedenle birlikte çöktürme deneylerimize elimizde bulunan III ve IV bölgeleri ile devam ettik. III ve IV bölgeleri ile HA işaretli Nfib arasındaki etkileşimi bulmak için anti-HA rezini kullanılarak yapılan birlikte çöktürme deneylerinde Myc işaretli BRG1 III ve IV bölgelerinin Nfib'nin yanında negatif kontrol ile de çöktüğünü belirledik. Yapılan bu öncül deneylerde epitop işaretli bu proteinlerin anti-HA resin ile nonspesifik olarak etkileşiyor olabileceği sonucuna ulaştık. Bu BRG1 bölgelerinin NFI proteinleri ile beraber çöküp çökmeyeceği birlikte çöktürme deneyleri ile incelenecektir.
Özet (Çeviri)
Nuclear factor I (NFI) protein family of transcription factors regulate gene expression and viral DNA replication via binding to certain DNA sequences. There are four different NFI genes (NFIA, NFIB, NFIC and NFIX) of which sequences are conserved between vertebrates. The four vertebrate NFI genes are alternatively spliced to bring about multiple transcript variants from each gene. NFI proteins bind to TTGGC(N5)GCCAA sequences on double-stranded DNA with high affinity, and to TTGGC and GCCAA sequences with low affinity. NFI protein family share an N-terminal region for DNA-binding and dimerization, and a C-terminal region that activate/repress gene expression. The N-terminal site is a 220 amino acid long structure that is conserved between all vertebrates. This site includes four cysteine amino acids. Three of the cysteines participate in DNA binding and dimerization. The C-terminal site of NFI is the region that varies between the four NFI genes. Alternative splicing of the C-terminal site generates various NFI proteins from each gene. This site functions in the repression or activation of the expression from target genes. Therefore, NFI proteins are also known as transcription factors. Three NFI family members, NFIA, NFIB and NFIX play important roles in neural development. Defects in the development of cerebral cortex, hippocampus as well as, spinal cord and cerebellum in Nfi knockouts mice show that NFIs are required for central nervous system development. Expression of all three nervous system specific NFIs are detected in neurons, astrocytes and oligodendrocytes. NFI transcription factors interact with a variety of genes and proteins to regulate gene expression. In the hindbrain NFIA interacts with other transcription factors, such as Sox9 and Sox10 to regulate glial differentiation. NFIs can also bind chromatin modifiers: co-immunoprecipitation and co-localization experiments in HeLa cells and T lymphocytes carried out by Zhao L. et al (2005) show that the NFI transcription factor binds to BRG1 and the RNA polymerase II enzyme in order to activate transcription. BRG1/BRM Associated Factor (BAF) complex is an epigenetic factor that uses its Brahma Associated Gene 1 (BRG1) ATPase subunit to utilize the released ATP energy and in this way alters the target chromatin structures. Although similar in structure to the yeast SWI/SNF complex, the mammalian BAF complex is 2 megadaltons size and has at least 15 distinct subunits. Combinations of various subunits present in different cell types can generate numerous distinct BAF complexes engaged in differential interactions. The BAF complex can interact with transcription factors in order to activate or repress expression of a target gene. Therefore, its function is essential for many developmental processes. For instance, Brg1-/- mouse exhibits neural tube formation defects in the early stages of mouse development. Silencing of Brg1 expression in neural progenitor cells prevents regeneration of and thereby causes a decrease in the number of neural cells. As BRG1 and NFI both are involved in regulation of gene expression during development and had been shown to interact in nonneural cells, we wanted to explore this interaction further. We carried out overexpression and co-immunoprecipitation studies to determine if these interactions are found in neural cell lines and are NFI member specific. To this end, epitope tagged BRG1 and NFI proteins were overexpressed in HEK293T cells and their interaction was analyzed by co-immunoprecipitation experiments. We showed that FLAG-BRG1 is precipitated by all HA-NFI family members. We also showed by reciprocal co-immunoprecipitation experiments NFIB and NFIX are indeed precipitated by BRG1, while preliminary data indicate that NFIA and NFIC may also interact with BRG1. In addition, we performed co-immunoprecipitation experiments using SH-SY5Y neuroblastoma nuclear extracts enriched in endogenous BRG1 and NFI proteins. Interestingly, this cell line expresses NFIB in higher amounts when compared to other NFI proteins. We were unable to determine if NFIB is precipitated by BRG1, studies using different primary antibodies and antibody controls are undergoing to obtain definitive results. BRG1 protein comprises four different domains. The first domain is a Proline-rich domain that plays a role in protein-protein interactions. The second domain is a conserved region of unknown function. The third domain is the enzymatic ATPase domain that is involved in chromatin remodeling whereas the fourth domain is involved in the interaction of BRG1 with acetylated histone tails. In this study, we also wanted to identify the domains through which BRG1 interacts with NFIB. We set out to generate mammalian expression constructs including Myc-tagged BRG1 domains I and II by recombination and obtained vectors encoding Myc-tagged BRG1 domains III and IV and the full-length BRG1 from Joan Massague. Preliminary experiments employing anti-HA antibodies and the domains III and IV showed that these epitope tagged proteins may interact nonspecifically with anti-HA resin. Co-immunoprecipitation experiments where BRG1 domains will be carried out to determine whether NFI proteins do precipitate with any of these domains.
Benzer Tezler
- Investigation of the interactions between NFIB and potential binding partners MAD2B and ATXN3
NFIB proteininin potansiyel bağlanma partnerleri olan ATXN3 ve MAD2B ile etkileşiminin araştırılması
EDA YILMAZYILDIRIM
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- In vitro and in silico investigation of NFIB-SUMO interactions
NFIB-SUMO etkileşimlerinin in vitro ve in silico olarak incelenmesi
AYBERK ÖZKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- In vitro investigation of the interactions of nuclear factor one proteins with transcriptional regulators PIN1 and LMO4
Nükleer faktor ı proteinlerinin transkripsiyonel ragülatörler PIN1 ve LMO4 ile etkileşimlerinin in vitro olarak araştırılması
SİNEM SARITAŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2016
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR
- Otistik özellik gösteren sağlıklı bireylerde mizah algısının ve EEG konnektivitesinin incelenmesi
Investigation of humor perception and EEG connectivity in healthy individuals with autistic traits
SİMGE AYKAN ZERGEROĞLU
- Arazi kullanımı-ulaşım etkileşiminin irdelenmesi: Sultangazi örneği
Investigation of the interaction between land use and transportation: An example for Sultangazi Istanbul
İZZET MUTLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Ulaşımİstanbul Teknik ÜniversitesiUlaştırma Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. HÜSEYİN ONUR TEZCAN