İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning, expression in E. coli, characterization of human carbonic anhydrase ii (hCA II) enzyme, production of mutant hCA II genes by site directed mutagenesis and investigation of affinity of mutant proteins to inhibitors
- Tez No: 470911
- Danışmanlar: PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 148
Özet
İnsan karbonik anhidraz II (hCA II) enzimi ilk kez pET SUMO ekspresyon vektörü kullanılarak E. coli'de eksprese edildi ve rekombinant enzim, nikel (Ni+2) afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. hCA II'nin hidrofobik kısmındaki Trp 209 aminoasiti, bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile dört farklı amino asit (Val, Leu, Ile ve Pro) ile yer değiştirdi. hCA II varyantlarının p-nitrofenilasetat esteraz aktivitesi, hidrofobiklik ve rezüdü hacmi ile ilişkilidir, bu bilgi Trp 209 rezidüsünün hidrofobikliğinin katalizleme için önem taşıdığını düşündürmektedir. Bu rezidü önemli bir rezidü olarak tahmin edildi ve bu rezidünün hesaplamalı mutagenezi gerçekleştirildi. Bu öngörü, hCAII mutantlarını (W209V, W209L, W209I, W209P) deneysel olarak üreterek ve bazı benzenesülfonamidlere karşı ilgilerini belirleyerek teyit edildi. Dört mutant enzim doğal tip enzimle kıyaslandığında, benzensülfonamidlere karşı daha az ilgi gösterdi. W209V mutantı, doğal tip enzim ile benzer spesifik aktivite değerlerine sahipken; W209P, W209L ve W209I mutantları doğal tip enzime kıyasla p-nitrofenil esteraz aktivitesinde sırasıyla %60, %30 ve %20 oranında daha az aktif olduğu belirlendi. Enzimin aktif bölgesinin hidrofobik kısmındaki bu mutasyonlar, çözünmeyen protein agregatlarının oluşumuna neden olduğundan, E. coli'de hCA II'nin protein ekspresyonunu azalttı. Bu çalışmadaki bulgularımız hCA II'deki Trp 209'un katlanma sürecinde önemli rol oynadığını ve valin rezidüsünün bu izoenzimin aktif boşluğundaki hidrofobik bölge ile çok uyumlu olduğunu gösterdi. Bu mutant proteinler, gelecekte enzimin yapısal fonksiyonlarının ve ilaç temelli çalışmalarının anlaşılmasına yol açacaktır.
Özet (Çeviri)
Human carbonic anhydrase II (hCA II) enzyme was firstly expressed using pET SUMO expression vector in E. coli and the recombinant enzyme was purified using nickel (Ni2+) affinity chromatography. The substitutions of Trp 209 with four amino acid (Val, Leu, Ile, and Pro) in the hydrophobic pocket of hCA II were made using site-directed mutagenesis. The p-nitrophenyl esterase activity of hCA II variants correlate with the hydrophobicity and size of residue, suggesting that the hydrophobic character of this residue is important for catalysis. The Trp 209 was forecast as an important residue and was exposed to computational mutagenesis. This forecast was confirmed experimentally by producing hCA II mutants (W209V, W209L, W209I, W209P) and determining the resulting affinities towards some benzenesulfonamides. Affinity for benzenesulfonamides was reduced in the four mutants compared to wild type (wt). The W209V mutant showed similar specific activity values with the wt enzyme, whereas the W209P, W209L and W209I mutants were less active around 60%, 30%, 20% in p-nitrophenyl esterase activity compared to the wt, respectively. These mutations in the hydrophobic pocket of the enzyme active site decreased the protein expression of hCA II in E. coli, causing the formation of insoluble protein aggregates in many cases. Our findings demonstrated that the Trp 209 in hCA II plays important role the folding process and the valine residues are very compatible for hydrophobic region in active cavity of this isoenzyme. These mutant proteins will lead to the understanding of structural functions of enzyme and drug-based studies in the future.
Benzer Tezler
- İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning and expression of human carbonic anhydrase I(HCA I)gene in E.coli and investigation of affinity of the mutant enzyme to the inhibitors which is obtained site directed mutagenesis of Phe91Asn
MELTEM AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
BiyolojiBalıkesir ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. FERAY KÖÇKAR
PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- Aminopiridin türevlerinin ve metal komplekslerinin insan karbonik anhidraz enzimi üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of aminopyridine derivatives and their metal complexes on human carbonic anhydrase enzyme
GÖZDE İMDAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyokimyaKütahya Dumlupınar ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. METİN BÜLBÜL
- Eritrositlerden karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi ve uygulanması
Application and synthesis of a new affinity gel for the purification of carbonic anhydrase isoenzymes from the erythrocytes
ÖZEN ÖZENSOY
- Bazı yeni pirazol sülfonamid türevlerinin sentezi ve insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Synthesis of some new pyrazole sulfonamide derivatives and investigation of inhibition effects on human erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes
İRFAN YETEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
KimyaKütahya Dumlupınar ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RAHMİ KASIMOĞULLARI
- Benzotiyazol türevlerinin ve metal komplekslerinin insan eritrosit karbonik anhidraz enzimleri üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of benzothiazole derivatives and their metal complexes on human erythrocyte carbonic anyhrases
YASEMİN KAYGISIZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyokimyaDumlupınar ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. METİN BÜLBÜL