Geri Dön

İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

Cloning, expression in E. coli, characterization of human carbonic anhydrase ii (hCA II) enzyme, production of mutant hCA II genes by site directed mutagenesis and investigation of affinity of mutant proteins to inhibitors

  1. Tez No: 470911
  2. Yazar: DERYANUR KILIÇ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Kimya, Chemistry
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Atatürk Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 148

Özet

İnsan karbonik anhidraz II (hCA II) enzimi ilk kez pET SUMO ekspresyon vektörü kullanılarak E. coli'de eksprese edildi ve rekombinant enzim, nikel (Ni+2) afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. hCA II'nin hidrofobik kısmındaki Trp 209 aminoasiti, bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile dört farklı amino asit (Val, Leu, Ile ve Pro) ile yer değiştirdi. hCA II varyantlarının p-nitrofenilasetat esteraz aktivitesi, hidrofobiklik ve rezüdü hacmi ile ilişkilidir, bu bilgi Trp 209 rezidüsünün hidrofobikliğinin katalizleme için önem taşıdığını düşündürmektedir. Bu rezidü önemli bir rezidü olarak tahmin edildi ve bu rezidünün hesaplamalı mutagenezi gerçekleştirildi. Bu öngörü, hCAII mutantlarını (W209V, W209L, W209I, W209P) deneysel olarak üreterek ve bazı benzenesülfonamidlere karşı ilgilerini belirleyerek teyit edildi. Dört mutant enzim doğal tip enzimle kıyaslandığında, benzensülfonamidlere karşı daha az ilgi gösterdi. W209V mutantı, doğal tip enzim ile benzer spesifik aktivite değerlerine sahipken; W209P, W209L ve W209I mutantları doğal tip enzime kıyasla p-nitrofenil esteraz aktivitesinde sırasıyla %60, %30 ve %20 oranında daha az aktif olduğu belirlendi. Enzimin aktif bölgesinin hidrofobik kısmındaki bu mutasyonlar, çözünmeyen protein agregatlarının oluşumuna neden olduğundan, E. coli'de hCA II'nin protein ekspresyonunu azalttı. Bu çalışmadaki bulgularımız hCA II'deki Trp 209'un katlanma sürecinde önemli rol oynadığını ve valin rezidüsünün bu izoenzimin aktif boşluğundaki hidrofobik bölge ile çok uyumlu olduğunu gösterdi. Bu mutant proteinler, gelecekte enzimin yapısal fonksiyonlarının ve ilaç temelli çalışmalarının anlaşılmasına yol açacaktır.

Özet (Çeviri)

Human carbonic anhydrase II (hCA II) enzyme was firstly expressed using pET SUMO expression vector in E. coli and the recombinant enzyme was purified using nickel (Ni2+) affinity chromatography. The substitutions of Trp 209 with four amino acid (Val, Leu, Ile, and Pro) in the hydrophobic pocket of hCA II were made using site-directed mutagenesis. The p-nitrophenyl esterase activity of hCA II variants correlate with the hydrophobicity and size of residue, suggesting that the hydrophobic character of this residue is important for catalysis. The Trp 209 was forecast as an important residue and was exposed to computational mutagenesis. This forecast was confirmed experimentally by producing hCA II mutants (W209V, W209L, W209I, W209P) and determining the resulting affinities towards some benzenesulfonamides. Affinity for benzenesulfonamides was reduced in the four mutants compared to wild type (wt). The W209V mutant showed similar specific activity values with the wt enzyme, whereas the W209P, W209L and W209I mutants were less active around 60%, 30%, 20% in p-nitrophenyl esterase activity compared to the wt, respectively. These mutations in the hydrophobic pocket of the enzyme active site decreased the protein expression of hCA II in E. coli, causing the formation of insoluble protein aggregates in many cases. Our findings demonstrated that the Trp 209 in hCA II plays important role the folding process and the valine residues are very compatible for hydrophobic region in active cavity of this isoenzyme. These mutant proteins will lead to the understanding of structural functions of enzyme and drug-based studies in the future.

Benzer Tezler

  1. İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

    Cloning and expression of human carbonic anhydrase I(HCA I)gene in E.coli and investigation of affinity of the mutant enzyme to the inhibitors which is obtained site directed mutagenesis of Phe91Asn

    MELTEM AYDIN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2007

    BiyolojiBalıkesir Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. FERAY KÖÇKAR

    PROF.DR. OKTAY ARSLAN

  2. Aminopiridin türevlerinin ve metal komplekslerinin insan karbonik anhidraz enzimi üzerine etkisinin incelenmesi

    Investigation of the effect of aminopyridine derivatives and their metal complexes on human carbonic anhydrase enzyme

    GÖZDE İMDAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyokimyaKütahya Dumlupınar Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. METİN BÜLBÜL

  3. Eritrositlerden karbonik anhidraz izoenzimlerinin saflaştırılması için yeni bir afinite jelinin sentezi ve uygulanması

    Application and synthesis of a new affinity gel for the purification of carbonic anhydrase isoenzymes from the erythrocytes

    ÖZEN ÖZENSOY

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2002

    KimyaBalıkesir Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ.DR. OKTAY ARSLAN

  4. Bazı yeni pirazol sülfonamid türevlerinin sentezi ve insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerinin incelenmesi

    Synthesis of some new pyrazole sulfonamide derivatives and investigation of inhibition effects on human erythrocyte carbonic anhydrase isoenzymes

    İRFAN YETEK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    KimyaKütahya Dumlupınar Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. RAHMİ KASIMOĞULLARI

  5. Benzotiyazol türevlerinin ve metal komplekslerinin insan eritrosit karbonik anhidraz enzimleri üzerine etkilerinin incelenmesi

    Investigation of the effects of benzothiazole derivatives and their metal complexes on human erythrocyte carbonic anyhrases

    YASEMİN KAYGISIZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyokimyaDumlupınar Üniversitesi

    Biyokimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. METİN BÜLBÜL