İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning and expression of human carbonic anhydrase I(HCA I)gene in E.coli and investigation of affinity of the mutant enzyme to the inhibitors which is obtained site directed mutagenesis of Phe91Asn
- Tez No: 178030
- Danışmanlar: DOÇ.DR. FERAY KÖÇKAR, PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Afinite kromatografisi, Ekspresyon, Glokom, nhibisyon, Karbonik Anhidraz, Klonlama, Yönlendirilmis mutagenez, Affinity choromatography, Carbonic anhydrase, Cloning, Expression, Glaucoma, nhibition, Site-directed mutagenesis
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
?nsan Karbonik Anhidraz (HCA I) (Karbonat hidroliyaz E.C. 4.2.1.1) 8. kromozomun uzun kolunda lokalize olan 30kDa büyüklüğünde bir proteindir. Eritrositlerde, kolon epitelinde, göz lensi ve korneal epitelyumda bulunur. Hücre içinde çözülebilir formda sitozolde yer alan HCA I eritrositlerde hemoglobinden sonra en bol bulunan proteindir. Yüksek göz içi basıncını düsürmek amacıyla glokom hastalığının tedavisinde kullanılan sülfonamidlerin HCA II izoenziminin yanında HCA I izoenzimini de önemli ölçüde inhibe ettiği saptanmıstır. Bu nedenle arastırmamızda sülfonamidlere karsı daha az ilgili mutant HCA I enzimleri elde edilmesi planlanmıstır. Bu amaçla insan hCA I geni, RT-PCR stratejisi ile HL60 hücre hattından pGEM-T vektörüne ve daha sonra pET21a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. Phe91 hidrofobik rezidüsü PCR 'a dayalı yönlendirilmis mutagenez stratejisi ile daha hidrofilik olan Asn rezidüsüne dönüstürüldü. Yabani ve mutant HCA I enzimlerinin ekspresyonu E.coli 'de gerçeklestirildi. Spesifik Sefaroz-4B-L-Tirozin afinite jeli kullanılarak saflastırıldı, hidrataz aktiviteleri belirlendi. Glokom tedavisinde sıklıkla kullanılan sülfonamid ve asetozolamide karsı inhibisyonu arastırıldı. Yabani tip HCA I enziminin aksine (IC50 = 1.257x10-4M), Phe91Asn mutantı, 0.468x10-4M IC50 değeri ile sülfonamide karsı daha yüksek afinite göstermistir. Asetozolamide karsı yabani (IC50 = 1.376x 10-6M) ve mutant (IC50 =1.283x10-6M) HCA I enzimleri arasında önemli bir inhibisyon farkı tespit edilmemistir.
Özet (Çeviri)
Human Carbonic Anhydrase (HCA I) (Carbonate hydroliyase E.C. 4.2.1.1) is a protein with 30kDa weight and situated on the long arm of chromosome 8. It presents in erythrocytes, colon ephithelium, lens of eye and corneal ephithelium. HCA I is the most abundant protein after hemoglobin in erythrocytes which is found in cytosol and has soluble form. It?s found that sulfonamides which are used in glaucoma treatment to reduce inner eye pressure in glaucoma, inhibit not only HCA II isoenzyme but also HCA I remarkably. For this aim, in this study it was planned to obtain mutant HCA I enzymes which have low affinity to sulfonamides. Therefore hCA I gene has been cloned from HL60 (Human acute myeloid leukemic cell line) by RT-PCR strategy and was cloned into pGEMT and subsequently into pET21a(+) expression vector. Phe91 hydrophobic residue was changed into more hidrophilic Asn residue with PCR based site directed mutagenesis. The expression of wild type and mutant HCA I enzymes was performed in E.coli. Wild and mutant HCA I enzymes were purified by specific Sepharose 4B-L-Tyrosine affinity gel and hydratase and esterase activities measured. Inhibition manner of these enzymes by Sulphonilamide and acetozolamide widely used for the treatment of glaucoma was investigated. Phe91Asn mutant (IC50 =0.468x10-5M) has higher inhibition affinity than wild type HCA I with IC50 values of IC50 = 1.257x10-5M to sulphonilamide. It wasn?t defined important inhibition difference of wild type (IC50 = 1.376x 10-6M) and Phe91Asn mutant enzyme (IC50 =1.283x10-6M) to acetozolamide.
Benzer Tezler
- İnsan karbonik anhidraz izoenzimleri (hCA I-II) üzerine 4-metilbenzensülfonamid türevlerinin inhibisyon etkisinin incelenmesi
Investigation of inhibition effect of 4-methylbenzenesulfonamide derivatives on human carbonic anhydrase isoenzymes (hCA I-II)
ASİYE EFE
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyokimyaAğrı İbrahim Çeçen ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. EMİR ALPER TÜRKOĞLU
- İnsan eritrositlerinden saflaştırılan karbonik anhidraz izoenzimleri (HCA-I ve HCA-II) üzerine bazı kemoterapi ilaçların etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effect of some chemotherapeutic drugs on human carbonic anhydrase izoenzymes (HCA-I AND HCA-II)
FEVZİ TOPAL
- Manyetik alanın insan eritrosit karbonik anhidraz izoenzimleri (hCA I ve hCA II)üzerine in vitro etkilerinin araştırılması
The investigation of effects of magnetic field on human erythrocytes carbonic anhydrase isoenzymes in vitro
SEMA COŞKUN
Yüksek Lisans
Türkçe
2007
BiyokimyaBalıkesir ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. HAKAN KÖÇKAR
PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- Oktopamin: Antioksidan kapasitesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri (hCA I ve hCA II) üzerine etkisi
Octopamine: Its antioxidant capacity and its effect on human carbonic anhydrase izoenzymes hCA I ve hCA II
CÜNEYT ÇAĞLAYAN
- Sinefrin ve fenilefrin: Antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve insan karbonik anhidraz izoenzimleri (hCA I ve hCA II) ile asetilkolin esteraz enzimi üzerine etkilerinin araştırılması
Synephrin and phenylephrine: Determinaton of theirs antioxidant capacity and investigation of their effects on human carbonic anhydrase izoenzymes (hCA I ve hCA II) and acetylcholin esterase enzyme
HÜLYA GÖÇER