İnsan karbonik anhidraz I (HCA I)geninin klonlanması, E.coli'de ekspresyonu ve Phe91Asn yönlendirilmiş mutageneziyle elde edilen mutant enzimin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning and expression of human carbonic anhydrase I(HCA I)gene in E.coli and investigation of affinity of the mutant enzyme to the inhibitors which is obtained site directed mutagenesis of Phe91Asn
- Tez No: 178030
- Danışmanlar: DOÇ.DR. FERAY KÖÇKAR, PROF.DR. OKTAY ARSLAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2007
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 117
Özet
?nsan Karbonik Anhidraz (HCA I) (Karbonat hidroliyaz E.C. 4.2.1.1) 8. kromozomun uzun kolunda lokalize olan 30kDa büyüklüğünde bir proteindir. Eritrositlerde, kolon epitelinde, göz lensi ve korneal epitelyumda bulunur. Hücre içinde çözülebilir formda sitozolde yer alan HCA I eritrositlerde hemoglobinden sonra en bol bulunan proteindir. Yüksek göz içi basıncını düsürmek amacıyla glokom hastalığının tedavisinde kullanılan sülfonamidlerin HCA II izoenziminin yanında HCA I izoenzimini de önemli ölçüde inhibe ettiği saptanmıstır. Bu nedenle arastırmamızda sülfonamidlere karsı daha az ilgili mutant HCA I enzimleri elde edilmesi planlanmıstır. Bu amaçla insan hCA I geni, RT-PCR stratejisi ile HL60 hücre hattından pGEM-T vektörüne ve daha sonra pET21a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. Phe91 hidrofobik rezidüsü PCR 'a dayalı yönlendirilmis mutagenez stratejisi ile daha hidrofilik olan Asn rezidüsüne dönüstürüldü. Yabani ve mutant HCA I enzimlerinin ekspresyonu E.coli 'de gerçeklestirildi. Spesifik Sefaroz-4B-L-Tirozin afinite jeli kullanılarak saflastırıldı, hidrataz aktiviteleri belirlendi. Glokom tedavisinde sıklıkla kullanılan sülfonamid ve asetozolamide karsı inhibisyonu arastırıldı. Yabani tip HCA I enziminin aksine (IC50 = 1.257x10-4M), Phe91Asn mutantı, 0.468x10-4M IC50 değeri ile sülfonamide karsı daha yüksek afinite göstermistir. Asetozolamide karsı yabani (IC50 = 1.376x 10-6M) ve mutant (IC50 =1.283x10-6M) HCA I enzimleri arasında önemli bir inhibisyon farkı tespit edilmemistir. ANAHTAR SÖZCÜKLER : Afinite kromatografisi, Ekspresyon, Glokom, ?nhibisyon, Karbonik Anhidraz, Klonlama, Yönlendirilmis mutagenez, ,
Özet (Çeviri)
Human Carbonic Anhydrase (HCA I) (Carbonate hydroliyase E.C. 4.2.1.1) is a protein with 30kDa weight and situated on the long arm of chromosome 8. It presents in erythrocytes, colon ephithelium, lens of eye and corneal ephithelium. HCA I is the most abundant protein after hemoglobin in erythrocytes which is found in cytosol and has soluble form. It?s found that sulfonamides which are used in glaucoma treatment to reduce inner eye pressure in glaucoma, inhibit not only HCA II isoenzyme but also HCA I remarkably. For this aim, in this study it was planned to obtain mutant HCA I enzymes which have low affinity to sulfonamides. Therefore hCA I gene has been cloned from HL60 (Human acute myeloid leukemic cell line) by RT-PCR strategy and was cloned into pGEMT and subsequently into pET21a(+) expression vector. Phe91 hydrophobic residue was changed into more hidrophilic Asn residue with PCR based site directed mutagenesis. The expression of wild type and mutant HCA I enzymes was performed in E.coli. Wild and mutant HCA I enzymes were purified by specific Sepharose 4B-L-Tyrosine affinity gel and hydratase and esterase activities measured. Inhibition manner of these enzymes by Sulphonilamide and acetozolamide widely used for the treatment of glaucoma was investigated. Phe91Asn mutant (IC50 =0.468x10-5M) has higher inhibition affinity than wild type HCA I with IC50 values of IC50 = 1.257x10-5M to sulphonilamide. It wasn?t defined important inhibition difference of wild type (IC50 = 1.376x 10-6M) and Phe91Asn mutant enzyme (IC50 =1.283x10-6M) to acetozolamide. KEY WORDS: Affinity choromatography, Carbonic anhydrase, Cloning, Expression, Glaucoma, ?nhibition, Site-directed mutagenesis,
Benzer Tezler
- İndol türevi schiff bazı bileşiklerinin insan karbonik anhidraz izoenzimleri ve asetilkolinesteraz enzimi üzerine etki mekanizmaları
Mechanisms of effect of indole derivative schiff base some compounds on human carbonic anhydrase isoenzymes and acetylcholinesterase enzyme
EBRU AKMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyokimyaErzincan Binali Yıldırım ÜniversitesiFarmasötik Bilimler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ESRA DİLEK
- Çivit otu türü, Isatis glauca Aucher ex Boiss. subsp. glauca bitkisinden saflaştırılan metabolitlerin enzim inhibisyon etkilerinin belirlenmesi
Identification of the enzyme inhibition effects of metabolites purified from Isatis glauca Aucher ex Boiss. subsp. glauca plant
NİMET AKBAŞ
- Bazı yeni hidrazon türevlerinin sentezi, karakterizasyonu ve karbonik anhidraz ve kolinesteraz enzim inhibisyon aktivitelerinin incelenmesi
Synthesis, characterization of some new hydrazone derivatives and investigation of their carbonic anhydrase and cholinesterase enzyme inhibition activities
BERNA AKIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyokimyaBatman ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. REŞİT ÇAKMAK
PROF. DR. MURAT ŞENTÜRK
- Effects of some angiotensin converting enzyme-inhibitor drugs used for heart diseases on esterase activity of human carbonic anhydrase I and II
İnsan karbonik anhidraz I ve II'nin esteraz aktivitesi üzerine kalp hastalığında kullanılan bazı anjiyotensin dönüştürücü enzim-inhibitör ilaçlarının etkileri
MOHAMMED SALAH MALALLAH AL-TAMEEMI
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
BiyokimyaYıldız Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BARBAROS NALBANTOĞLU
- Bazı doğal maddelerin insan karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri üzerindeki inhibitör etkilerinin incelenmesi
Investigation of the inhibitory effects of some natural substances on human carbonic anhydrase I and II isoenzymes
TUNAY ÇELİK
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyokimyaAğrı İbrahim Çeçen ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ KADİRİYE URUÇ PARLAK