Geri Dön

Cloning, heterologous expression and purification of PHI 29 DNA polymerase variants

PHI 29 DNA polimeraz türevlerinin klonlanması, heterolog ekspresyonu ve saflaştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 485252
  2. Yazar: FATMA ARAS
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NURAN DEVECİ AKSOY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Biochemistry, Biotechnology, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2017
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 87

Özet

Tüm canlı organizmalar genetik bilgilerini soylarının devamlılığı için gelecek nesillere aktarırlar. Başarılı bir aktarımın sırrı ise organizmaların sahip olduğu DNA polimerazlarda yatmaktadır. DNA replikasyonundaki rolünün yanısıra, bu polimerazlar organizmaların yaşam döngülerinde önemli bir yer tutan protein sentezinde de görev almaktadırlar. Günümüzde, hücre içi genetik materyalin izolasyonu ve çoğaltılması moleküler biyoloji ve moleküler tıptaki in vitro çalışmalar için hayati derecede öneme sahiptir. Nükleik asit çoğaltma tekniklerinden örneğin polimerizasyon zincir rekasiyonu (PCR) çok miktarda DNA parçalarının kısa bir sürede sentezlenmesi için geliştirilmiştir. PCR, oligonükleotid primerler yardımıyla DNA polimeraz enziminin spesifik DNA dizilimlerini çoğalttığı bir tekniktir. DNA polimeraz enzimleri farklı biyokimyasal ve fizikokimyasal özelliklerine göre sınıflandırılmalarına rağmen, polimerizasyon reaksiyon mekanizmalarını benzer şekilde yürütmektedirler. Bacillus subtilis faj φ29, replikasyon süreci boyunca φ29 DNA polimeraz ile lineer çift DNA zincirli genomunu yeniden üretmek için doğal bir mekanizma işletmektedir. ''Viral gen 2'' ürünü olan φ29 DNA polimeraz şaşırtıcı işlevselliği ve düzelticilik aktivitesi sayesinde son yıllarda DNA analiz çalışmalarında büyük bir ilgi görmektedir. φ29 DNA polimeraz enzimi yüksek kalitede hem çok kompleks DNA dizilimlerini çoğaltırken, hemde DNA yapısında meydana gelmiş mutasyonların çok kısa bir sürede tespit edilmesine imkan vermektedir. Diğer DNA polimerazlarda da bulunan 5'-3' polimerizasyon aktivitesinin yanısıra, 3'-5' ekzonükleaz aktivitesi sayesinde polimerizasyon reaksiyonu boyunca yanlış eşleşmiş baz çiftlerinin düzeltilmesi işlevini de gerçekleştirmektedir. DNA çoğaltılması sürecinde aktif rol alan φ29 DNA polimeraz'ın biyokimyasal özellikleri farklı analiz çalışmalarıyla gün yüzüne çıkartılmıştır. Fakat sadece sınırlı sayıda füzyon proteinleri tanımlanmıştır. Bu çalışmada, Streptavidin yüzeyine proteinin immobilizasyonunu sağlayan Streptavidin bağlayıcı peptit (SBP etiketi) ile bağlanmış φ29 DNA polimeraz türevlerinin üretimi ve saflaştırılması rekombinant DNA teknolojisi sayesinde başarıyla gerçekleştirilmiştir. Rekombinant proteinin üretimine ait deneysel süreç, proteinin karakteristik özellikleriyle uyumlu bir bakteriyel ekspresyon sisteminin dizaynı ile başlamaktadır. Sentetik φ29 DNA polimeraz genine sahip rekombinant ekspresyon vektörünün konak bakteri hücrelerine transferi sonrası, hücreler uygun besi ortamında geliştirilir ve bakteri kültürlerinden proteinin özütlenmesi ile devam eden süreç, proteinin afinite kolonu kullanılarak saflaştırılması ve karakterizasyon çalışmalarının yapılmasıyla tamamlanmaktadır. Deneyde kullanılan sentetik gen; yapısındaki φ29 DNA polimeraz genine ek olarak esnek bir bağlayıcıya, SBP etiketine ve yapışkan uçlara sahiptir. Yapışkan uçlar rekombinant vektörün oluşturulmasında kullanılır iken, SBP etiketi afinite kromatografisinde proteinin kolona bağlanmasını sağlamak için yapıya ilave edilmiştir. Esnek bağlayıcı ise proteinin hareket kabiliyetini artırmak amacıyla kullanılmıştır. Ayrıca esnek bağlayıcı ile φ29 DNA polimeraz ve RFP proteini aynı yapıda buluşturularak füzyon proteinin biyolojik aktivitesi artırılmış ve proteinler arasındaki olası etkileşim en aza indirilmiştir. Bakteriyel ekspresyon sistemi; düşük maliyeti, hızlı çoğalma özelliği ve genetik modifikasyonlara uyumluluğu ile rekombinant protein sentezinde yaygın olarak kullanılan E.coli kullanılarak oluşturulmuştur. pET serisi plazmid vektör ise rekombinant proteinin üretiminde görev almıştır. Rekombinant vektörün oluşturulması ve akabinde bakteri hücrelerine transferi ile klonlama işlemi tamamlanmıştır. Seçilen bakteri kolonileri LB besi ortamında inkübe edilmiştir. Ticari Miniprep seti ile bakterilerin sahip olduğu bu rekombinant vektörler DNA sekanslama işlemi için izole edilmiştir. Sekanslama sonuçlarına göre tasarlanan yapıya sahip olan vektörler ile protein sentezine başlanmış ve elde edilen numuneler saflaştırma işlemi için hazır hale getirilirmiştir. Protein örnekleri kolon kromatografisi öncesinde bir takım ön saflaştırma işlemlerinden geçirilmiştir. Bunlar; hem mekanik hemde kimyasal etki ile istenmeyen bakteriyel genom, tek veya çift iplik DNA kalıntıları, hücre duvarı vb. uzaklaştırılması için uygulanmıştır. Kromatografi kolonunda, destek malzemesine sabitlenmiş özel ligandlar ile protein afinite etiketi arasındaki tersinir ilişkiye dayanarak proteinler saflaştırılır. Bu işlemin önemli noktalarından bir diğeri ise yıkama tampon çözeltisinde SBP-etiketi ile afinite açısından yarışarak proteinin kolondan ayrılmasını sağlayan ikinci bir ligand olmasıdır. Saflaştırma sonrası protein örneklerinin beklenen moleküler ağırlığa sahip olup olmadığı ve saflaştırmanın ne derece başarılı olduğu SDS-PAGE analizi ile belirlenmiştir. SDS jellerinin görüntülenmesiyle literatürde belirtilen moleküler ağırlığına sahip φ29 DNA polimeraz sentezinin başarıyla gerçekleştirildiği kanıtlanmıştır. In vitro çalışmalarda DNA polimerazların aktivitelerinin ölçülmesi zaruri bir ihtiyaç olarak karşımıza çıkmaktadır. Radyoizotop kullanılarak gerçekleştirilen geleneksel aktivite ölçüm metotları bu çalışmada getirdiği riskler sebebiyle tercih edilmemiştirler. Bunun yerine, yeni bir teknik olan moleküler işaret analizi yapılmıştır, çünkü bu analiz φ29 DNA polimeraz enziminin hızlı, kolay ve hassas karakterizasyonunu mümkün kılmaktadır. Polimerizasyon reaksiyonu boyunca özel DNA şablonunun yapısında bulunan florofor'a ait yayılım değerlerinin aralıklarla ölçülmesiyle aktivite testi tamamlanmıştır. Aktivite testi sonuçlarına göre, ticari ve in vitro sentezlenmiş φ29 DNA polimerazlar yaklaşık aynı performansa sahiptir. Fakat aktivite testlerindeki her bir negatif kontrol örneklerindeki konakçı E.coli hücrelerine ait DNA tarafından kaynaklanan DNA kirliliği büyük bir problem yaratmaktadır. φ29 DNA polimeraz hem tek hemde çift zincirli DNA'ya karşı yüksek afiniteye sahip olduğu için, E.coli genomunun ve vektör DNA kalıntılarının hücre lizis aşamasında tamamen uzaklaştırılması gerekmektedir. Ancak afinite kromatografisi sonrası bu istenmeyen DNA parçalarından kurtulmak kolay değildir. Çok fonksiyonlu rekombinant füzyon proteinleri farklı fonksiyonel protein bölgelerini aynı rekombinant protein yapısında bir araya getirmenin yanısıra proteinlerin biyoaktivitesini de artırmaktadır. Bu nedenle, RFP proteini ile etiketlenmiş diğer bir φ29 DNA polimeraz enzimi de önceden φ29 DNA polimeraz sentezi için uygulanmış heterolog protein ekspresyon prosedürü takip edilerek sentezlenmiştir. φ29-RFP DNA polimeraz enzimi de yine Streptavidin bağlayıcı peptit ile afinite kromatografisi sayesinde saflaştırılmıştır. Enzimatik aktivite sonuçlarına göre, φ29-RFP DNA polimeraz enzimi de iyi bir sonuç vermektedir. İkinci olarak, SDS jel görüntülerine göre φ29-RFP DNA polimeraz enzimi bütünüyle ve istenilen moleküler ağırlıkta sentezlenmiştir, fakat jelde farklı protein bantları da görülmektedir. Bu çoklu bantların birçok farklı sebepleri olabilir. Örneğin, φ29-RFP DNA polimeraz enzimi amino asit bileşimine tamamen uymamış olabilir yada RFP ve φ29 DNA polimeraz birleşme noktasında ayrılma meydana gelmiş olabilir. Protein sentezinin yarıda kesilmiş olma ihtimali de yüksektir. Bunlar füzyon protein ekspresyonunda sıkça karşılaşılan problemlerdir. Fakat, farklı bir başlatıcıya sahip vektör kullanılarak bu sorunların üstesinden gelinilebilir. φ29-RFP DNA polimeraz enzimi yapısında bulunan esnek bağlayıcıların füzyon proteine hareket kabiliyeti sağladığı bilinen bir gerçektir. Ancak, iki farklı proteinden oluşan bu yapının bozunmaması için yeterli dayanıklılığa sahip değildirler. Esnek bağlayıcılar yerine sabit bağlayıcıların kullanılması daha yüksek verimde istenilen proteinlerin elde edilmesine olanak sağlayacaktır. Son olarak, UV-absorbsiyon ölçümü ile sentezlenen proteinlerin konsantrasyon değerleri belirlenmiştir. Her iki φ29 DNA polimeraz ve φ29-RFP DNA polimeraz enzimlerinin konsantrasyonları ticari φ29 DNA polimeraz ile kıyaslandığında düşük olduğu tespit edilmiştir. Deneysel süreçte meydana gelen bir takım olumsuzluklar bu düşük konsantrasyonun sebebi olabilirler. Bunların üstesinden gelmek için, indüksiyon sıcaklığı yada süresi değiştirilebilir. Bakteri kültürlerinin besi ortamı da içerik bakımından zenginleştirilirse üretimde verimliliğin artırılması muhtemeldir. Dahası, plazmid türünün yada ekspresyon sisteminin değiştirilmesi de çözüm olarak sunulabilir. Ayrıca protein örneklerinin ticari ürüne göre konsantrasyonları daha düşük olsa dahi, kayda değer büyüklükte aktivite değerlerine sahip oldukları görülmektedir.

Özet (Çeviri)

Today, isolation and amplification of intracellular genetic material have a vital importance for molecular biology and molecular medicine in vitro studies. Nucleic acid amplification techniques such as polymerization chain reaction (PCR) have been developed to synthesize very amount of DNA fragments in a short time. PCR is a technique in which DNA polymerase enzyme is used to amplify specific DNA sequences by the help of the oligonucleotide primers. DNA polymerase enzyme which synthesizes a complementary DNA plays an important role in the genome replication and in proteins synthesis. Bacillus subtilis phage φ(Phi)29 operate a natural DNA amplification mechanism to reproduce their linear double-stranded DNA genome with φ29 DNA polymerase during the replication process. φ29 DNA polymerase, the product of viral gene 2, gained a lot of interest in the field of DNA analytics in the recent years due to its astonishing processivity and proofreading activity. However, only a limited number of genetic fusion proteins have been described. In this study, the production and purification of φ29 DNA polymerase variants fused to a Streptavidin binding peptide to enable the immobilization of the polymerase on Streptavidin modified surfaces were carried out. The φ29 DNA polymerase enzyme was successfully produced in the bacterial expression system thanks to the recombinant DNA technology. After protein purification in affinity chromatography system, a molecular beacon assay was performed to measure the activity of the φ29 DNA polymerase because it allows rapid and quantitative characterization of DNA polymerases activity. Both commercial and in vitro synthesized φ29 DNA polymerases have approximately the same performance according to the activity results. However, DNA contamination which revealed itself in each negative control samples of activity tests was a major problem caused by the DNA of E.coli host cells. Since φ29 DNA polymerases have a high affinity for both ssDNA and ds DNA, the genomic DNA of E.coli and residues of vector DNA should have immediately removed in cell lysis step, but it is not easy to get rid of these undesired DNA fragments later on affinity chromatography. Besides combining the different functional domains of proteins in the same recombinant protein structure, multifunctional recombinant fusion proteins increase the biological activity of proteins. Another φ29 DNA polymerase labeled with a red fluorescent protein (RFP) was expressed by following the same heterologous protein expression procedures that previously applied for φ29 DNA polymerase synthesis. The purpose of the junction of RFP protein is to detect the φ29 DNA polymerase during polymerization reactions. The φ29-RFP DNA polymerase enzyme was also purified by affinity chromatography using streptavidin binding peptide. According to the enzymatic activity results, φ29-RFP DNA polymerase also brought to a successful conclusion, but DNA contamination issue revealed itself again. Secondly, in accordance with the SDS gel images, φ29-RFP DNA polymerase is expressed at full-length and the expected size, but there were different protein bands. There may be various reasons related with these multiple bands. For instance, it may have not completely abided by the amino acid composition of Φ29-RFP DNA polymerase, or cleavage at the junction between RFP and φ29 DNA polymerase might have taken place. These are the most commonly encountered problem in fusion protein expression. Finally, both φ29 DNA polymerase and φ29-RFP DNA polymerase concentrations were detected at low level in comparison to commercial φ29 DNA polymerase concentration, but solution-orientated approaches are also given in this thesis study.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    482468

    Cloning, heterologous expression and purification of various wax ester synthases in Escherichia coli

    Çeşitli mum esteri sentazların Escherichia coli'de klonlanması, heterolog ekspresyonu ve saflaştırılması

    KAMİL OVACIK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyokimyaİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALPER ARSLANOĞLU

    YRD. DOÇ. DR. NUR BAŞAK SÜRMELİ

    DOÇ. DR. SERAP EVRAN

  2. Tez No

    315382

    Cloning of The Laccase cDNAs from Pycnoporus sanguineus MUCL 38531, Expression in Pichia pastoris and Characterization of Recombinant Laccases

    Pycnoporus sanguineus?tan Lakkaz cDNA?larının Klonlanması, Pichia pastoris?te Ekspresyonu ve Rekombinant Lakkazların Karakterizasyonu

    GÜNSELİ KURT GÜR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

  3. Tez No

    392232

    Investigations on the n-linked glycosylation of the Aspergillus niger lipase in pichia pastoris

    Aspergillus niger lipaz'in Pichia pastoris'deki n-bağlı glikozilasyon ile ilgili araştırma

    SERKAN SIRLI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyomühendislikSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. OSMAN UĞUR SEZERMAN

  4. Tez No

    900342

    Bacillus mojavensis TH309 tipII I-asparajinaz geninin klonlaması ve heterolog ifadesi

    Cloning and heterolog expression of the bacillus mojavensis TH309 type II I-asparaginase gene

    RAGHD BAHAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ALİ OSMAN ADIGÜZEL

  5. Tez No

    762311

    Bacillus mojavensis TH309 türüne ait pektat liyazın (BmoPelA) saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Purification and characterization of pectate lyase (BmoPelA) from Bacillus mojavensis TH309

    SÜMEYYE CİLMELİ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MÜNİR TUNÇER

Geri Dön