Yeni anti-theilerial ilaçların geliştirilmesi için theileria annulata peptidil prolil izomeraz geninin klonlanması ve inhibitör adaylarının in silico incelenmesi
Theileria annulata peptidyl prolyl isomerase gene cloning and in silico analysis of candidate inhibitors for new anti-theilerial drug design
- Tez No: 495358
- Danışmanlar: PROF. DR. DİLEK BALIK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2017
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 142
Özet
Geleneksel yöntemlerle yeni ilaçların geliştirilmesi pahalıdır ve uzun yıllar sürmektedir. Son yıllarda, bilgisayar destekli ilaç tasarımı, maliyet ve zaman gereksinimlerini önemli ölçüde azalttığı için yeni ilaç keşfi ve geliştirilmesi alanında büyük önem kazanmıştır. T. annulata, dünya çapında milyonlarca sığırı tehdit eden tropikal theileriosise neden olmaktadır. Theileriosisin tedavisinde anti-theilerial ilaç olan buparvaquone kullanılmaktadır. Ancak, son zamanlarda Theileria annulata'nın ilaç direncinin bildirilmesi, theileriosisin tedavi edilmesi için yeni ilaç adaylarının keşfedilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmaktadır. Tez çalışmasında, ileri in vitro karakterizasyon ve inhibitör test çalışmalarında kullanılmak üzere Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz geni (TaPIN1) klonlanmış olup, inhibitor kütüphanesi in silico taranarak ilaç direnci rapor edilmiş TaPIN1'in inhibisyonuna yönelik aday moleküllerin belirlenmesi ve önerilen yaklaşımın aşırı ifade edilmiş Ras/Neu proteinlerce indüklenen insan PIN1 enzim kaynaklı kanserlerin tedavi edilmesine yönelik kurgunun yapılması gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının klonlama aşamasında ilk olarak, Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz enzimini kodlayan dizi polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilmiştir. Ardından, pLATE31 vektör sistemine aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. İntron bölgesi, Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit ile uzaklaştırılıp intronsuz rekombinant DNA E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilmiştir. İntronun uzaklaştırıldığı ve doğru gen dizisinin insersiyonu, DNA dizilime ile teyit edilmiş ve ileri çalışmlar için hazır hale getirilmiştir. Tez çalışmasının bilgisayar destekli ilaç keşfi aşamasının ilk adımında, mutant ve yabanıl tip TaPIN1'in homoloji modelleri, MODELLER v9.15 yazılımı ile belirlenmiş olup, modellerin doğruluğu, çeşitli web sunucuları kullanılarak teyit edilmiştir. PubChem veri bankası kullanılarak oluşturulan 2979 naftokinon türevlerini içeren sanal kütüphane mutant TaPIN1'e karşı Schrödinger Glide HTVS, SP ve XP kenetlenme metodolojilerine göre taranmıştır. Kenetli bileşikler Glide Extra Precision (XP) skorlama fonksiyonu ile sıralanmış ve serbest bağlanma enerjileri Prime MM-GBSA yöntemi ile hesaplanmıştır. XP skor sıralamasına göre ilk iki sırada yer alan kenetli bileşikler (5304752 ve 9993782 Pubchem numaralı bileşikler) moleküler dinamik simülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. AMBER programı kullanılarak, ligand bağlı olmadan yabanıl tip ve mutant TaPIN1'in simülasyonu 50 ns, ligand bağlı yapıların simülasyonu 100 ns'de gerçekleştirilmiştir. 5304752 PubChem numaralı ligandın hem yabanıl tip hem mutant TaPIN1'in aktif bölgesinde bulunduğu gözlenmiştir ve potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. 9993782 PubChem numaralı ligandın yabanıl tip TaPIN1'in aktif bölgesinin dışında konumlandığı gözlenmiştir, fakat mutant TaPIN1'in aktif bölgesine yakın bir yerde bulunduğu gözlenmiştir ve mutant enzime karşı potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. Ayrıca, bu sonuçlar doğrultusunda, öngörülen inhibitörler, TaPIN1 ile aynı mekanizmayı kullanarak, insanlarda kanser oluşumuna neden olan insan peptidil prolil enzimi (hPIN1) için de potansiyel inhibitörler olabileceği öngörülmüştür.
Özet (Çeviri)
The development of new drugs with conventional methods is expensive and takes many years. Computer-aided drug discovery has gained great importance in the field of new drug discovery and development due to reduced cost and time requirements significantly in recent years. T. annulata causes the tropical theileriosis which threatens millions of cattle worldwide. Anti-theilerial drug buparvaquone is used to treat theileriosis. However, drug resistance reports in Theileria annulata suggest that new drug candidates need to be discovered to treat theileriosis. In the thesis study, TaPIN1 was cloned to be used for further in vitro characterization and inhibitor testing studies, inhibitor library was screened in silico for identification of candidate molecules to inhibit drug resistant TaPIN1 and the treatment of human peptidyl prolyl cis/trans isomerase enzyme derived cancers has been devised with proposed approach. In the first step of the cloning phase, peptidyl prolyl cis/trans isomerase coding sequence was amplified by PCR from T. annulata genome, then amplified gene was cloned into pLATE31 vector system and transformed into E. coli BL21 (DE3) cells. After that a non-coding region intron was removed by using Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit and the recombinant DNA was transformed into E. coli BL21 (DE3) cells. Removal of intron and insertion of the correct gene sequence was confirmed by DNA sequencing and was made ready for further studies. In the first step of computer aided drug discovery, comparative models of the mutant and wild-type of TaPIN1 were predicted by MODELLER v9.15 software and structure validation was performed by using various types of web-servers. Library of naphthoquinone derivatives was downloaded from the PubChem and was screened by the Schrödinger Glide HTVS, SP and XP docking methodologies. The docked compounds were ranked by the Glide Extra Precision (XP) scoring function and binding free energy of the docked compounds was calculated by Prime MM-GBSA method. The two highest ranks of the docked compounds (Pubchem IDs: 5304752 and 9993782) were used for molecular dynamic (MD) simulations studies. MD simulations for ligand unbound and bound proteins were performed for 50 ns and 100 ns respectively by using AMBER software. 5304752 ligand was located in the active site of both wild type and mutant TaPIN1 enzymes, accordingly 5304752 was predicted as potential inhibitor. 9993782 ligand was located outside of the active site binding pocket of the wild-type TaPIN1 enzyme. However, the presence of the ligand near the active site of the mutant TaPIN1, suggests that ligand can be predicted as a potential inhibitor for mutant enzyme. Also, identified ligands were speculated as potential inhibitors against human peptidyl prolyl isomerase enzyme which causes cancer in humans by using the same mechanism as TaPIN1.
Benzer Tezler
- Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin ilaç ve aşı tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analiz edilmesi
Isolation, cloning and analysis of the gene encoding enolase from Theileria annulata for drug and vaccine designing studies
AYBERK AKAT
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. DİLEK TURGUT-BALIK
- Theileria parva'nın laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve ekspresyonu
Isolation, cloning and expression of the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme from Theileria parva
IRMAK İÇEN
- Theılerıa annulata'nın laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin analizi
Analysis of gene from theileria annulata coding lactate dehydrogenase enzyme
BELMA NURAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK BALIK
- Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu
Cloning of enolase gene without intron, expression, purification and kinetic characterization of the enzyme from Theileria annulata
EBRU ÇAYIR
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyokimyaYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK BALIK
- Theileria annulata'nın laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin ilaç tasarım çalışmalarında kullanılmak üzere izolasyonu, klonlanması ve analizi
Isolation, cloning and analysis of the enyzme encoding lactate dehydrogenase gene from Theileria annulata for drug design studies
AYŞEGÜL ERDEMİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. DİLEK TURGUT-BALIK