Construction and characterization of solid-supported lipid bilayers to investigate cell-surface interactions
Hücre–yüzey etkileşimlerinin incelenmesi için yüzey-destekli lipid zarların oluşturulması ve karakterizasyonu
- Tez No: 496465
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 162
Özet
Hücre-hücre/biyomolekül ve hücre-yüzey etkileşimlerinin araştırılması, hücre sinyal iletimi, hücre tutunma, çoğalma ve farklılaşma gibi temel mekanizmaları anlamak için önem arz etmektedir. Bu mekanizmalara ilişkin edinilecek detaylı bilgiler, etkin tıbbi sistemlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi gibi konularda da aydınlatıcı olmaktadır. Yüzey-destekli Yapay Lipid Membranlar (YLM) özgül biyolojik etkileşimlerden sorumlu biyoaktif moleküller ile işlevselleştirildiğinde biyolojik zarların temel özelliklerinin incelenmesi, biyosensör yapımı, ilaç tarama platformları, kanser hücresi tespit platformları ve hücre-hücre / biyomolekül, hücre-yüzey etkileşimlerinin incelenmesi gibi birçok pratik uygulama için uzun süreli deneylere imkân sağlamaktadırlar. Biyomimetik YLM platformlar ayrıca atomik kuvvet spektroskopisi, yüzey plazmon spektroskopisi (SPR) ve disipasyon-izlemeli kuvartz kristal mikroterazi (QCM-D) gibi yüzeye-hassas karakterizasyon tekniklerinin kullanılmasına izin verir. Bu tez çalışması kapsamında, hücre-yüzey etkileşimlerini araştırmak için işlevsel YLM platformu oluşturulması ve tüm sürecin QCM-D sistemi kullanılarak gerçek-zamanlı takip edilmesi amaçlanmıştır. Bu şekilde mikroskop altında ayırt edilmesi mümkün olmayan hücre-yüzey etkileşimlerindeki değişikliklerin (yüzey özelliklerine, hücre tipine ve zamana bağlı) araştırılması mümkün olabilmektedir. Bu maksatla YLM yüzeyleri RGD ve osteokalsin mimetik (OSN) peptidleri ile işlevselleştirilmiş ve bu yüzeylerin osteoblast hücreleri ile etkileşimi incelenmiştir. RGD peptidi, çeşitli hücre dışı matris proteinlerinin bağlanma motifi olduğundan hücre tutunmasını teşvik ettiği için; OSN peptidi de hücre tutunmasından ziyade biyomineralizasyonu desteklediği bilindiğinden kontrol olarak seçilmiştir. Karşılaştırma maksadıyla paralel çalışmalar, benzer platformlar kullanılarak hücre kültür ortamında da gerçekleştirilmiştir. Tezin ilk kısmı tek aşamada oluşturulacak bir YLM platformu tasarlamak üzerine odaklanmaktadır. Polar yüzeyli lipozomların, muamele edilmemiş, hidrofobik altın yüzeyler ile etkileşime girmemesi nedeniyle, altın kaplı sensörler üzerinde yapılan model lipid membran çalışmalarının çoğunda lipozomların kırılıp-parçalanması ve lipid membran oluşumunu başlatması için çeşitli yüzey-modifikasyon stratejileri kullanılır. Tezin bu bölümünde, altın sensör yüzeyler üzerinde ayrıca bir modifikasyona gerek kalmadan, fosfatidilkolin temelli lipozomlara thiol-modifiye bir fosfolipid olan 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glisero-3-Phosphothioethanol (DPPTE) dâhil edilerek YLM oluşturulması amaçlandı. Farklı DPPTE oran (% 0,01 ila % 100 mol/mol) ve çaplarında lipozomların bağlanma kinetikleri QCM-D ile izlendi. Sonuçların yorumlanması için iki rijit (...) ve iki viskoelastik (...) katman referans olarak kullanıldı. Viskoelastisite derecesi olarak değerlendirilen, frekans değişikliği başına düşen disipasyon değişimi, yani akustik oranın, DPPTE varlığında önemli ölçüde düştüğü gözlemlendi (yassılaşmış PC lipozomlar için 162,3 GHz-1 iken, % 100 DPPTE içeren lipozomlar için yaklaşık 89,5 GHz-1). YLM platformunun niteliğini değerlendirmek için, kuvartz kristal mikroterazi verilerine ek olarak yüzey plasmon spektroskopisi sonuçları da kullanıldı. QCM-D katmanlardaki su oranına da hassas iken, SPRnin su oranından bağımsız sonuçlar vermesi iki tekniğin sonuçlarının karşılaştırılarak daha gerçekçi yorumlar yapılmasına olanak sağladı. Optimum tiyollü-lipid oranı (% 1, daha düşük tiyol oranı ve daha yüksek rijitlik) ile elde edilen veriler, viskoelastik modelleme yoluyla yüzeydeki kuru-lipid miktarını, katman içi su miktarını ve kalınlık değerlerini hesaplamak için kullanıldı. Yüzey karakterizasyonu çalışmaları ek olarak AFM kullanılarak yüksek uzaysal çözünürlük ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, model membranın minimum defektlerle neredeyse bütün/kesintisiz olduğunu, ancak kısmen kaynaşmış lipozom / üst üste gelmiş kimi lipid membran katmanları / çoklu lipid katman adacıkları nedeniyle de ideal bir lipid membrana kıyasla daha fazla disipasyona sahip olduğunu göstermiştir. Lipid membrandaki bu bölgesel yükseltiler membranın düzlemselliği kısmen bozarak genel membran kalınlığının ~ 7.0 nm'ye yükselmesine neden olmuştur. Buna rağmen tek aşamada altın üzerinde YLZ oluşturulması başarılı bir biçimde gerçekleştirilmiştir. Tezin ikinci bölümünde, QCM-D sistemi kullanılarak hücre - yüzey etkileşimlerinin nasıl gerçek zamanlı takip edileceği ve ne gibi değerlendirmeler yapılabileceği konusunda önçalışmalar yürütülmesi amaçlandı. Bunun için YLZ sistemi kullanılmadan değişik yüzeyler hazırlandı ve hücreler ile 18 saatlik etkileşimleri takip edilerek sinyal değişiklikleri yorumlandı. İlk olarak, insan fetal osteoblastik kemik (hfOB) hücre hattının dinamik tutunma davranışı, referans substratlar olarak, muamele edilmemiş hidrofobik ve hidrofilik kılınmış altın sensör yüzeyler üzerinde izlendi. Değerlendirmeyi kolaylaştırmak için hücre tutunması ışık mikroskopisi altında da gözlemlenerek sonuçlar karşılaştırıldı. Hücrelerin hidrofilik altın yüzeylerde yüzey temas alanlarını daha fazla arttırıp daha fazla yayıldığı görülmüştür. Ayrıca hücre dışı matrisin yeniden biçimlenmesi ile ilişkilendirilen hücre-yüzey arayüzünde artan rijitlik bu yüzeylerde daha yüksek gözlemlenmiştir. Bu önçalışmadan sonra, tutunma kuvveti ve kinetiği, hücre tutucu (poli-L-lisin ve fibronektin) ve itici (sığır serum albümin) yüzeyler üzerinde de karakterize edildi. Sonuçlar, protein aracılı özgül etkileşimlerin frekans değişiminden (Δf) çok disipasyonda (ΔD) veya akustik oranda (ΔD / Δf) değişime katkıda bulunduğunu gösterdi. Son olarak, QCM-D'nin sağlıklı ve kanserli hücreleri ayırt etme potansiyeli, hfOB hücrelerinin ve SaOS-2 (osteosarkom) kanserli hücrelerin sonuçları ile karşılaştırarak değerlendirildi. Kanserli hücrelerin referans yüzeylerle daha güçlü etkileştiği ve sağlıklı hücrelere göre daha fazla viskoelastik karakteristik gösterdiği gözlemlendi. Tezin son bölümünde, YLM'lerin RGD ve OSN ile işlevselleştirilmesi ve bu sistemlerin hücreler ile etkileşimlerinin QCM-D ile incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun için ilk olarak, lipid membranların stabilitesi çeşitli ortam koşullarında belirlendi. PBS içerisinde, membranın yapısal bütünlüğünün beşinci güne kadar korunduğu gözlenirken, serumlu besiyeri ortamında ilk günden itibaren delikler oluşmaya başlamış, sayı ve boyutları zamanla artmıştır. Farklı lipidlerle (kolesterol, PS, DOTAP) zenginleştirilmiş YLM'lerin saf PC-YLM'a göre stabiliteleri artmıştır. Yapay lipid membranın yanal hareketliliği de FRAP yöntemi ile gösterildi. YLM'nin hem stabilite hem de akışkanlık karakterizasyonundan sonra, YLM yüzeylere peptit bağlanma kinetiği incelenerek altın yüzeylerine spesifik olmayan adsorpsiyonları ile karşılaştırıldı ve oluşan katmanların özellikleri QCM-D ile analiz edildi. Sonuçlar, YLM'ye konjüge edilmiş peptidlerin, pasif adsorpsiyonla yüzeye bağlanmışlara kıyasla daha yüksek yapısal esneklik taşıdığını gösterdi. Hücreler bu yüzeylerle inkübe edildiğinde, YLM platformlarındaki düşük yoğunluğa sahip hareketli RGD peptidlerin biyolojik aktivitelerini korudukları ve altın yüzeylerdeki yüksek sayıda hareketsiz peptitten daha etkili şekilde hücre adezyonunu arttırdığı görüldü. RGD-fYLM yüzeylerinde gözlenen hücre bağlanması ve yayılması, hücre kültüründe de doğrulanmıştır. Yalın YLM yüzeyine sınırlı sayıda hücre tutunmuş ve yuvarlak morfolojide kalmıştır. Hücreler OSN-kaplı yüzeylerde iyi yayılma göstermemiştir. Ölçülen yüksek akustik oranın hücrelerin spesifik tutunmasından kaynaklanmadığı, bunun yerine OSN'nin negatif yükü sayesinde yüzeye bağlanan proteinlerden kaynaklanan bir artış olduğu düşünülmüştür. Tez kapsamında esas olarak protein ve hücre tutunmasına dirençli olan YLM yüzeyleri başarılı bir şekilde işlevselleştirilmiş ve oluşturulan fYLM platformlarının, özgül hücre-yüzey etkileşimlerinin QCM-D aracılığıyla gerçek zamanlı ve işaretleme olmaksızın takip edilme potansiyeline sahip olduğu görülmüştür.
Özet (Çeviri)
Investigation of cell-cell/biomolecule and cell-surface interactions are essential to understand basic mechanisms such as cell signaling, attachment, proliferation and differentiation. Getting insight to these mechanisms also elucidates the topics such as the development and improvement of effective medical systems. Supported lipid bilayers (SLBs) when functionalized with bioactive molecules that are responsible for specific biological interactions, allow long-term experiments for many practical applications such as investigation of the basic features of biological membranes, construction of biosensors, drug screening platforms, cancer cell detection platforms and investigation of the cell–cell/biomolecule, cell-surface interactions. These biomimetic lipid bilayer platforms allow the usage of surface-sensitive characterization techniques such as atomic force spectroscopy (AFM), surface plasmon resonance (SPR) and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). The aim of the thesis is to construct functional SLB platform to investigate cell-surface interactions and to monitor whole process in real time via QCM-D system. In this way, it is possible to investigate changes in cell-surface interactions (surface characteristics, cell type and time dependent) that can not be distinguished under the microscope. SLB surfaces were functionalized with RGD, and osteocalcin mimetic (OSN) peptides and their interaction with osteoblast cells were evaluated. RGD is the binding motif of various extracellular matrix (ECM) proteins so it is expected to promote cell adhesion whereas OSN is known to promote biomineralization rather than cell attachment so chosen as control. Similar platforms were used in parallel in cell culture environment for comparison. The first part of the thesis focused on the construction of an SLB platform in single step. Most of the model lipid membrane studies on gold-coated sensors involve the usage of various surface-modification strategies to rupture liposomes and induce lipid bilayer formation since liposomes with polar surfaces do not interact with bare, hydrophobic gold. For this purpose, it was aimed to form SLB on gold sensor surfaces without further modification by incorporating a thiol-modified phospholipid, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphothioethanol (DPPTE) into phosphatidylcholine (PC) based liposomes. The binding kinetics of liposomes with different DPPTE ratio (0.01 to 100% mol/mol) and diameters were monitored by QCM-D. The dissipation change per frequency change, i.e., acoustic ratio, which is evaluated as a degree of the viscoelasticity, considerably decreased with the presence of DPPTE (from 162.3 GHz−1 for flattened PC liposomes to ca. 89.5 GHz−1 for 100% DPPTE liposomes) when compared to the results of two reference rigid monolayers and two viscoelastic layers. To assess the quality of SLB platform, the interpretation of QCM-D data was also complemented with Surface Plasmon Resonance. While QCM-D is sensitive to the liquid content within the layers, SPR provides liquid-independent results and thus the results of these techniques are compared to make more realistic interpretations. The optimum thiolated-lipid ratio (1%, lower thiol ratio and higher rigidity) was then used to determine the dry-lipid mass deposition, the water content and the thickness values of the SLB via viscoelastic modelling. Further, surface characterization studies were performed by Atomic Force Microscopy with high spatial resolution. The results suggested that model membrane was almost continuous with minimum defects but showed more dissipative/soft nature compared to an ideal bilayer due to partially fused liposomes/overlapped lipid bilayers/multilayer islands. These local elevations distorted the planarity and led the increase of overall membrane thickness to ∼7.0 nm. However, the construction of SLB on gold in a single step has been successfully accomplished. In the second part of the thesis, the aim was to obtain insight about how to evaluate cell – surface interactions in QCM-D system. QCM-D is one of the powerful techniques, which allow real time, quantitative and noninvasive analysis of the interaction of different cell types with various modified surfaces. For this purpose, different surfaces were prepared without using SLB system and their interaction with the cells for 18 h were interpreted. First, the dynamic adhesion behavior of human fetal osteoblastic bone (hfOB) cell lines was monitored on untreated and hydrophilically treated gold sensor surfaces as reference substrates. Adhesion was also observed under light microscopy to facilitate the evaluation. Cells increased their surface contact area and spread more on hydrophilic surfaces, and showed distinct profile with an increased rigidity at the cell-surface interfacial layer, which is assigned to extracellular matrix remodeling. Further, the adhesion strength and kinetics were characterized on cell adhesive (poly-L-lysine and fibronectin) and repellent (bovine serum albumin) surfaces. The overall results indicated that protein-mediated specific interactions contributed mostly to the dissipation changes (ΔD) or acoustic ratio (ΔD/Δf). Finally, the potential of QCM-D to distinguish healthy and cancerous cells were evaluated by comparing the results of hfOB cells with that of SaOS-2 (osteosarcoma) cancerous cells. Cancerous cells interacted more strongly with the surfaces and showed more viscoelastic characteristic than the healthy cells. In the final part of the thesis, SLB activation and functionalization with RGD and OSN peptides and examination of the interactions of these systems with cells via QCM-D were aimed. First, the stability of lipid bilayers in various medium conditions were evaluated. The structural integrity was conserved until fifth day in PBS, but hole formations started to form from the first day and increase their number and size in time under serum-supplemented medium conditions. SLBs enriched with different lipids (cholesterol, PS, DOTAP) increased the stability of SLB to pure PC. Lateral mobility of the lipid bilayer was also demonstrated via FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) method. After the SLB characterization for both stability and fluidity, the kinetics of peptide attachment to SLBs were compared to their nonspecific adsorption onto gold surfaces and the characteristic of resultant layers were analyzed via QCM-D. The results indicated that conjugation to SLB provide higher structural flexibility than passive adsorption. When cells were incubated with these surfaces, it was seen that low density of mobile RGD peptides on SLB platforms preserved their biological activity and promoted cell adhesion more efficiently than high number of immobile peptides on the gold surfaces. Cell attachment and spread on RGD-fSLB surfaces were also confirmed in cell culture. Limited number of cells were attached on bare SLB surface and they remained in rounded morphology. Cells did not spread well on OSN-coated surfaces, and acoustic ratio measured on each OSN layers probably did not originate from specific adhesion of the cells, instead the negative charge of OSN could provide electrostatic interactions between surface and biomolecules on the cell membrane, thus promoting nonspecific protein and cell attachment. In conclusion, nonfouling SLB surfaces were successfully functionalized and constructed fSLB platforms were shown to have the potential for real time and label-free monitoring of the specific cell – surface interactions via QCM-D.
Benzer Tezler
- Synthesis and characterization of toluene diisocyanate
Toluen diizosiyanat maddesinin sentezi ve karakterizasyonu
AYŞEGÜL HİSAR TELLİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
KimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖZDEMİR DOĞAN
- Hızlı kuruyan su bazlı kaplama malzemelerinin sentez ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of fast dry water based coating material
MAHİR KAPLAN
Doktora
Türkçe
2018
Polimer Bilim ve Teknolojisiİstanbul Üniversitesi-CerrahpaşaKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET KAŞGÖZ
- Hidrodinamik kavitasyon (HDK) destekli fenton prosesi ile sızıntı suyu arıtımının incelenmesi
Investigation of leachate treatment by hydrodynamic cavitation (HDC) supported fenton oxidation
MEHTAP DURSUN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Çevre MühendisliğiGebze Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NİHAL BEKTAŞ
- Nikelalüminat (NiO/Al2O3) nanopartiküllerinin üretimi
Production of NiO/Al2O3 nanocomposite particles
TUNÇAĞ CİHANGİR ŞEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Metalurji Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SEBAHATTİN GÜRMEN
- İyon seçici sol-jel film sentezi ve optik sensör olarak kullanmı
Ion selective sol-gel film synthesis and usage as optical sensor
MERVE UMUTLU