Cloning of TaqI endonuclease gene into E.coli and isolation of the enzyme by using pMAL-p2 vector system
pMAL-p2 vektör sistemi kullanılarak TaqI restriksiyon enzim geninin E.coli'ye klonlanması ve enzimin izolasyonu
- Tez No: 50542
- Danışmanlar: PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1996
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 103
Özet
VI izole ÖZET TaqI restriksiyon enzimi, Thermus aquaticus bakterisinin YT-1 susundan i edilmiş, DNA'yı 5' TCGA 3' sekansından tanıyıp kesen bir tip II restriksiyon enzimidir. TaqI, kalıtsal bir hastalığın varlığına işaret edebilecek ve insan genomunda bulunan birçok polimorflk bölgede tanıma sekansı olan, kalıtsal hastalıkların bağlantı analizinde ve bu polimorfik bölgelerin tespitinde sıkça kullanılan bir endonükleazdır. TaqI restriksiyon enziminin, doğal olarak bulunduğu Thermus aquaticus'da ekspresyonu çok düşüktür, ve enzimi bu organizmadan izole etmek hem ciddi teknik kısıtlamalar içerir hem de ekonomik değildir. Dolayısıyla, TaqI endonükleaz enzimini kodlayan genin E. colV ye klonlanması ve enzim izolasyonu için hızlı ve kolay metodların geliştirilmesi enzimin geniş çaplı kullanımı için kaçınılmaz olmuştur. Bu çalışma kapsamında, TaqI restriksiyon endonükleazını kodlayan gen, PCR yöntemiyle, özgün primerler tasarlanarak çoğaltılmış ve gen pMAL-p2 vektörüne, maltoza bağlanan protein (MBP) kodlayan, malE genine, sonunda MBP-TaqI endonükleaz fiizyon proteini üretmek üzere klonlanmıştır. Bu fiizyon protein, malE genindeki sinyal peptitler sayesinde periplazmaya geçtiğinden füzyon proteine periplazmada rastlanmıştır. Taramalar sonucunda doğru rekombinant oldukları belirlenen iki plazmidi, pH51 ve pH185 içeren iki koloni, cH51 ve cH185 bulunmuştur. Çalışmanın ikinci bölümünde, füzyon proteinin ekspresyonu ve TaqI endonükleaz akti vitesi cH185 isimli koloninin periplazmasında sitoplazmasında ve de LB ortamında bulunmuştur. Periplazmadaki ve sitoplazmadaki fiizyon proteini affinite kolon kromatografisi ile, ortamdaki proteinler ise tuzla doyurma yöntemi ile arındırılmıştır. Ortamdan izole edilen proteinin aktivitesi iki U/^ıl olarak belirlenmiştir. TaqI endonükleaz enziminin ortamdan izole edilebilmesi, enzimin üretilmesinde ve izolasyonunda büyük bir ekonomik avantaj sağlayabileceği için, bulgularımızı doğrulayacak daha detaylı çalışmalar gerekmektedir.
Özet (Çeviri)
ABSTRACT TaqI is a type II restriction endonuclease which has been purified from Thcrmus aquaticus YT-1 strain. The enzyme recognizes 5' TCGA 3' sequence, binds specifically and cleaves between the thymidine and cytosine residues leaving a 5' staggered end upon digestion. TaqI is found to have restriction sites at most of the polymorphic regions of human genome that would be a clue for genetic disorders and thus it is widely used in molecular biology for the detection of genetic polymorphisms and linkage analysis of genetic disorders. The expression level of TaqI in its native host is very low and also growing this organism and isolation of the enzyme in high yield involves serious technical difficulties and is very uneconomical. Therefore, cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene in E. coli and development of a rapid and easy method for its purification is considered to be very important for its further applications. In the framework of this study, the gene coding for TaqI restriction endonuclease has been amplified by PCR, designing specific primers to do forced cloning and the gene has been cloned into pMAL-p2 vector downstream from malE gene of E. coli, which encodes the maltose binding protein, resulting in the periplasmic expression of MBP-TaqI restriction endonuclease fusion protein in E. coli. Two correct recombinant strains, cH5 1 and cH185 were identified from screening tests harboring the constructed recombinant pH51 and pH185 vectors respectively. In the second part, the expression of the fusion protein has been investigated and TaqI endonuclease activity has been detected both in the periplasm and in the cytoplasm and also in the LB medium of cH185. The MBP-TaqI restriction endonuclease fusion protein has then been purified by using affinity column chromatography from the periplasmic and cytoplasmic elutes and by salting-out from the LB medium. The activity of the fusion protein that has been isolated from the medium was estimated to be two U/ul. Since the recovery of the TaqI endonuclease from the medium may offer a great economical advantage in the production of the enzyme, further investigations may be necessary in order to confirm these observations.
Benzer Tezler
- Cloning and expression of TagI endonuclease in E.coli by using the cloning vector pUC18
TaqI endonükleazının pUC18 klonlama vektörü kullanılarak E.coli'ye klonlanması ve üretimi
ZEYNEP PETEK ÇAKAR
Yüksek Lisans
İngilizce
1996
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiPROF.DR. BETÜL KIRDAR
PROF.DR. ZEYNEP İLSEN ÖNSAN
- Cloning of Taql endonuclease gene into E.coli and its expression
Taql endonükleaz geninin E.coli'ye klonlanması ve ekspresyonu
İZZET ENÜNLÜ
- Cloning and expression of TaqI restriction endonuclease gene using pmal-c2 vector system in different straints of escherichia coli
TaqI restriksiyon endonükleaz geninin pmal-c2 vektör sistemi kullanılarak değişik escherichia coli suşlarında klonlanması ve ekspresyonu
ELİF ÖZKIRIMLI
Yüksek Lisans
İngilizce
1998
Kimya MühendisliğiBoğaziçi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF.DR. BETÜL KIRDAR
- Bacillus subtilis'e ait selülaz genlerinin e.coli'de klonlanması
Cloning of Bacillus subtilis cellulase genes in e.coli
BAHRİ DEVRİM ÖZCAN
- Cloning of AtBOR4 gene to Medicago sativa L. (Leguminosa-Fabecea) to generate boron tolerant plant cultivar
AtBOR4 geninin bora karşı dirençli Medicago sativa L. geliştirilmesi amaçlı klonlanması
HÜSEYİN TOMBULOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2010
BiyolojiFatih ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. M.SERDAL SAKÇALI
YRD. DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ
