Geri Dön

Pichia pastoris GAP promotoru altında hücre dışı üretilen rekombinant proteinler için yarı-kesikli proses geliştirilmesi

Development of a fed-batch process for the production of recombinant proteins in Pichia pastoris under GAP promoter

PDF İndir

  1. Tez No: 533004
  2. Yazar: SEMİRAMİS YILMAZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET İNAN
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 137

Özet

Mikroorganizma kaynaklı biyoteknolojik ürünler için en temel operasyon basamağı üretimin gerçekleştirildiği fermantasyon sürecidir. Fermantasyon, kapalı bir alanda (biyoreaktör) kontrollü bir şekilde gerçekleştirilen hücre gelişimi olarak tanımlanabilir. Biyoreaktör, hücrelerin, çözünmüş oksijen konsantrasyonu (ÇO), pH, redox potansiyeli ve besleme hızı gibi önemli parametrelerin ayarlanabildiği tanımlı bir gelişim ortamında (medya) aseptik olarak çoğalmasını sağlar. Birçok değişkenin rol oynadığı böyle bir proseste değişkenlerin hepsi ayrı bir şekilde optimizasyonun hedefi olabilir. Protein üretiminin gerçekleştirildiği biyoproseslerde genellikle pahalı hammaddeler kullanılır, enerji tüketimi fazladır ve yüksek sermaye yatırımı gerektirir. Bu nedenle üretim sürecinde kaydedilecek en ufak bir gelişme bile toplam üretim maliyetini pozitif yönde etkileyecektir. Pichia pastoris ekspresyon sisteminin kullanıldığı üretimlerde yüksek hücre yoğunluğu ile çalışıldığından çeşitli teknik kısıtlamar ile karşılaşılmaktadır. Bu kısıtlamaların en önemlisi oksijen transferidir. Rekombinant P. pastoris mayasının oksijen kısıtlamasına verdiği tepkilerin sürekli sistemde sistematik analizleri sırasında hipoksik koşulların, spesifik ürün oluşum hızını (qp) 2,5 kat arttırdığı tespit edilmiştir. Bu tespite dayanarak geliştirilen yarı-kesikli hipoksik besleme protokolünde substrat beslemesi, oksijen kısıtlamasında hücrenin oksidatif metabolizmadan oksidofermentatif metabolizmaya geçerek glukozdan ürettiği etanol konsantrasyonuna göre ayarlanır. Bu tez kapsamında, P. pastoris mayasında spesifik gelişim hızının (μ) ve oksijen kısıtlamasının (hipoksia) hücre dışı protein üretimini ve hücrenin gelişim parametrelerini nasıl etkilediği araştırılmıştır. Bu amaçla, ksilanaz enzimini hücre dışı üreten P. pastoris üretim suşu ile aerobik koşullar altında 4 farklı spesifik gelişme hızında (μmax, 0,8μmax, 0,4μmax ve 0,2μmax) ve hipoksik koşullar altında 4 farklı etanol konsantrasyonunda (%1, %0,75, %0,5, %0,25 ethanol) glukoz beslemeli yarı-kesikli fermantasyonlar gerçekleştirilmiştir. Aerobik koşullarda yapılan üretimlerde kontrol parametresi olarak spesifik gelişme hızı (μ), hipoksik koşullarda yapılan üretimlerde ise etanol miktarı (%etOH) seçilmiştir. Üretim boyunca spesifik gelişme hızının belli bir değerde sabit kalması (sabit-μ stratejisi), substratın ortama hücrelerin belirlenen hızda gelişmesini (üstel gelişim) sağlayacak miktarlarda eklenmesi (üstel besleme stratejisi) ile sağlanmıştır. Hipoksik koşullarda gerçekleştirilen üretimlerde ise besleme hızı besiyeri ortamındaki etanol konsantrasyonunu çevrimiçi ölçen bir sensör tarafından otomatik olarak ayarlanarak etanol konsantrasyonunun sabit kalması sağlanmıştır. Gerçekleştirilen fermantasyonlarda hücrelerin gelişim, enzim üretim ve substrat tüketimleri ile ilgili spesifik hızları, verimleri ve katsayıları hesaplanmış, karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır.

Özet (Çeviri)

The most basic operation step for biotechnological products originating from microorganisms is the fermentation process where production is carried out. Fermentation can be defined as a controlled development of cell in a closed area (bioreactor). The bioreactor allows the cells to proliferate aseptically in a defined development environment (media) where important parameters such as dissolved oxygen concentration (DO), pH, redox potential and feed rate can be adjusted. In such a process where many variables play a role, all of the variables can be the target of optimization separately. In bioprocesses where protein production is carried out, expensive raw materials are usually used, energy consumption is high and requires high capital investment. Therefore, even the slightest improvement in the production process will positively affect the total cost of production. Various technical constraints are encountered in high cell density fermentations especially in Pichia pastoris expression system. The most important of these limitations is oxygen transfer. During the systematic analysis of the oxygen limitation response of recombinant P. pastoris strain, it has been found that hypoxic conditions increase the specific product formation rate (qp) by 2.5 fold. In the fed-batch hypoxic feeding protocol that was developed based on this detection, the substrate feed is adjusted according to the ethanol concentration produced by cells from glucose under oxygen limitation. In this study, the effects of specific growth rate (μ) and oxygen restriction (hypoxia) on growth and production parameters of recombinant P. pastoris strain expressing xylanase enzyme under the GAP promoter were investigated. For this purpose, the glucose limited fed-batch productions were performed at 4 different specific growth rates (μmax, 0.8μmax, 0.4μmax and 0.2μmax) under normoxic conditions where %DO value was controlled over %30 with the addition of pure oxygen when necessary. At the same time, hypoxic fed-batch fermentations were carried out where the concentration of ethanol in the culture were kept constant at 4 different values (1.0%, 0.75%, 0.5%, 0.25% v/v) assuming different hypoxia levels were created. In hypoxic fermentations, culture was supplied only with air, %DO was not controlled and allowed to fall to zero. In normoxic fermentations, the specific growth rate remained constant at a certain value (constant-μ strategy) by the addition of the substrate to the medium in a predefined amount (exponential feeding strategy) to allow the cells to develop at the specified rate (exponential growth). For constant-ethanol feeding strategy under hypoxic conditions, the feed rate is automatically adjusted by a sensor which has a probe immersed in the broth and a control unit connected to the feed pump. The sensor retained the ethanol concentration in the broth around the setpoint by controlling directly the action of feed pump. After performing all fermentations, performance of the processes were evaluated comparatively on the basis of specific rates, yields and coefficients related to cell growth, enzyme production and substrate consumptions. In the scope of this study, it was found that hypoxic conditions increased the cellular yield (YPX), specific product formation rate (qp) and volumetric efficiency (Qp) of the process by 2 fold while limiting the biomass formation (lowering the specific growth rate) in the glucose-limited fed-batch production under the control of GAP promoter. In addition to reducing the biomass waste and increasing the production efficiency, hypoxic conditions, especially for large-scale industrial production, have very important advantages such as the lack of pure oxygen supply to the system during the process, reduced heat generation and reduced cooling requirement due to the decrease in the amount of cells formed. In summary, it was shown in detail that fed-batch production under hypoxic conditions has several technical and economical advantages over the standart normoxic strategies which were most commonly applied and considered to be the most efficient for the recombinant productions under GAP promoter.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    463601

    Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris

    Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi

    ASLAN MASSAHI

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON

  2. Tez No

    441947

    Enhanced recombinant human growth hormone production by synchronous populations of two different strains of Pichia pastoris under GAP promoter

    Pichia pastoris'in iki farklı suşunun senkronize popülasyonları ile GAP promotörü altında ınsan büyüme hormonu üretimi

    DAMLA HÜCCETOĞULLARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  3. Tez No

    473247

    Transcriptional engineering of GAP promoter for improved recombinant protein production by Pichia pastoris

    Transkripsiyon mühendisliği yöntemleriyle tasarlanan GAP promotoru altında Pichia pastoris ile rekombinant protein üretiminin geliştirilmesi

    ÖZGE ATA AKYOL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. DIETHARD MATTANOVICH

  4. Tez No

    771602

    Pichia pastoris'te rekombinant kimozin üretiminin araştırılması

    Investigation of recombinant chymosin production in Pichia pastoris

    FATMA ERSÖZ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  5. Tez No

    461935

    Recombinant human growth hormone production under double promoters by Pichia pastoris

    İki promotor kontrolu altında Pichia pastoris ile rekombinant insan büyüme hormonu üretimi

    DUYGU YALÇINKAYA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. PINAR ÇALIK

    PROF. DR. HASAN TUNÇER ÖZDAMAR

Geri Dön