Geri Dön

Investigation of the effects of the bag-1 – hsc70/hsp70 interaction on the bag-1 complexes in erad mechanism and ubiquitin/proteasome system

Bag-1 – hsc70/hsp70 etkileşiminin erad yolağı ve ubikitin/proteazom sistemindeki bag-1 komplekslerine olan etkisinin incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 535873
  2. Yazar: EZGİ BAŞTÜRK
  3. Danışmanlar: DOÇ. GİZEM DİNLER DOĞANAY
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyofizik, Biyoloji, Genetik, Biophysics, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 113

Özet

Protein homeostazisi, hücrenin tüm protein bakım işlemlerini kapsayan genel bir terimdir. Protein fonksiyonu doğru katlanmaya bağlı olduğundan, protein kalite kontrolü (PQC), hücrenin hayatta kalmasını sağlayan protein homeostazisinin kurulması için esastır. Salgı ve membran proteinleri, doğru katlanma için endoplazmik retikuluma (ER) yönlendirilir. Tamamen katlanmış proteinler ER'den taşınırken, yanlış katlanmış/katlanmamış proteinler ER stresine yol açarak katlanmamış protein tepkisini (UPR) aktive eder ve dislokasyon yoluyla ER'dan ayrılarak ER-ilişkili yıkım (ERAD) mekanizması aracılığıyla proteolitik yıkım için ubikitin/proteazom sistemine (UPS) hedeflenir. Poli-ubikitin zincirleriyle etiketlenen proteinler RAD23 benzeri adaptör proteinler aracılığıyla proteazoma taşındıktan sonra, poli-ubikitin zincirleri deubikitinleyici enzimler (DUB'ler) yadımıyla kesilir ve proteinler proteolitik degradasyon için proteazomun 19S düzenleyici kapak bölgesinde bulunan AAA+ ATPaz altbirimleri ve/veya VCP/p97 aracılığıyla proteazomun 20S proteolitik çekirdek bölgesine doğru çekilir ve yıkıma uğrar. Çok fonksiyonlu BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) proteini, BAG ailesinin ilk keşfedilen üyesidir. Bu protein, 1995 yılında bir hormon reseptörü olan GR'nin ve anti-apoptotik Bcl-2 proteininin etkileşim partneri olarak keşfedilmiştir. Tüm BAG ailesi üyeleri, farklı protein sınıfları ile çeşitli etkileşimler sağlayan ortak karboksil ucu BAG domenleri içerirler. İnsanda BAG ailesi, işlevsel farklılıklara yol açan farklı amino ucu bölgelerine sahip altı proteinden oluşur. İnsan BAG-1 proteininin BAG-1S, BAG-1M ve BAG-1L olarak adlandırılan üç ana izoformu bulunmaktadır ve tüm izoformlar, farklı translasyon başlatma bölgelerinden başlayarak aynı mRNA transkriptinden sentezlenmektedir. BAG-1 izoformları BAG domeni ve ubikitin benzeri domenden (UbL) oluşan ortak karboksil ucu ve farklı amino ucu bölgelerine sahiptir. En büyük izoform BAG-1L bir nükleer lokalizasyon sinyaline (NLS) sahiptir, bu yüzden çoğunlukla nükleusta yer alır. Öte yandan, en küçük izoform BAG-1S sitoplazmada bulunur ve orta uzunluktaki izoform BAG-1M nükleus ve sitoplazma arasında yer değiştirir. Yine de BAG-1 izoformlarının lokalizasyonu, farklı sinyaller sonucunda değişebilir. Ek olarak, BAG-1 ifadesinin farklı tümör tiplerinde, özellikle meme kanserinde normal hücrelere kıyasla daha fazla olduğu bulunmuştur. BAG-1 çok yönlü bir etkileşim ağına sahiptir. BAG-1 etkileştiği Hsc70/Hsp70, Bcl-2, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1, E3 ligaz CHIP ve proteazom gibi proteinler aracılığıyla; protein katlanması, protein yıkımı, hücre sağ kalımı, transkripsiyon, translasyon ve apoptoz gibi önemli hücresel mekanizmaların regülasyonuna katkı sağlar. Bununla birlikte BAG-1, Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin nükleotid değişim faktörlerinden (NEF) biri olduğu için, BAG-1'in hücresel mekanizmaların çoğunu Hsp70 etkileşimi aracılığıyla düzenlediği düşünülmektedir. BAG-1:Hsp70 etkileşimi, Hsp70'in ATPaz domeninin IB ve IIB alt domenleri ile BAG-1 BAG domeninin heliks 2 ve heliks 3 bölgeleri arasında gerçekleşmektedir. Diğer taraftan BAG-1'in UbL domeni aracılığıyla ubikitin/proteazom sistemi ile de etkileştiği ve böylece protein katlanması ve protein bozunması sistemleri arasında bir bağlantı sağlayarak hücre içi protein döngüsünü düzenlediği düşünülmektedir. Laboratuvarımızdaki çalışmalarda elde edilen ön bulgular, BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle etkileştiğini göstermiştir. Hsp70 şaperonunun da ERAD mekanizması proteinlerinden biri olduğu ve Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin hücre içinde aktif olarak rol aldığı göz önünde bulundurulduğunda, BAG-1 etkileşimlerinin doğrudan ya da Hsp70 üzerinden dolaylı olarak gerçekleşmesi ihtimalleri mevcuttur. Bu çalışmayla, BAG-1:Hsp70 etkileşim bölgesinde BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlar ile etkileşimin bozulması hedeflenmiş ve bu durumun ERAD yolağında görev alan diğer BAG-1 etkileşimlerine olan etkisi hem yapısal hem de deneysel olarak incelenmiştir. Bu amaçla BAG-1:Hsp70 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak nokta mutasyonları (BAG domeni üzerinde yer alan R205D, R206E ve R237D) belirlenmiştir. Ayrıca domen kontrolü olarak UbL domeni üzerinde I82K mutasyonu belirlenmiştir. Nokta mutasyonları, Protein Veri Bankası'ndan (PDB) elde edilen üç boyutlu BAG domeni yapısına uygulanmış ve mutasyonların BAG-1:protein etkileşimlerine olan etkisi in siliko olarak PRISM web sunucusu ve FoldX yazılımı aracılığıyla incelenmiştir. Belirlenen mutasyonlar yönlendirilmiş mutagenez yöntemiyle N-ucu TAP etiketli BAG-1S gen dizisine uygulanmış ve mutant plazmitler meme kanseri hücre hattı MCF-7 hücrelerine aktarılmıştır. TAP-etiketi saflaştırma yöntemiyle kompleks halinde saflaştırılan proteinler kütle spektrometresiyle yarı-kantitatif olarak analiz edilerek mutant BAG-1S proteinlerinin etkileşim partnerleri tanımlanmış ve komplekslerdeki proteinlerin miktarları belirlenmiştir. İn siliko analizler sonucunda, BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlarının üçünün de (R205D, R206E, R238D) BAG-1:Hsp70 etkileşiminin stabilitesini azalttığı, öte yandan proteazomal hedeflemede görevli VCP/p97 ile olan olası etkileşimi ise bozduğu saptanmıştır. Yapılan yarı-kantitatif kütle spektrometresi analizleri sonucunda, mutant BAG-1 proteinlerinin Hsp70 şaperonuyla olan etkileşimlerinin azaldığı, buna ek olarak R205D mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini bozarken, R206E mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini ciddi oranda azalttığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda; yabanıl tip, BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş, mutant ve yabanıl tip BAG-1S aşırı ifadesi sağlanmış MCF-7 meme kanseri hücrelerinin 20S ve 26S proteazom aktiviteleri incelenmiştir. Yapılan analiz sonucunda BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücrelerin 20S ve 26S proteazom aktivitelerinin ciddi oranda azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca, olası VCP/p97 etkileşimini bozan R205D ve ciddi oranda azaltan R206E mutantlarının aktarıldığı MCF-7 hücrelerinin proteazom aktivitelerinin de BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücreler ile benzer bir biçimde azaldığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, BAG-1 proteininin ubikitin/proteazom sisteminde VCP/p97 aracılı olarak görev aldığını düşündürmüştür. Elde edilen bulgular BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasında oluşan komplekslerde yer aldığını ve bu mekanizmada şaperonlar ve bir AAA+ ATPaz olan VCP/p97 ile kompleks oluşturarak substratların proteazoma taşınımında görev alabileceğini önermiştir. Gelecekte fonksiyon analizlerine yönelik çalışmalar ile bu çalışmadan ortaya çıkan hipotezler test edilerek araştırılacaktır. Uzun vadede hedeflenen, BAG-1:VCP/p97 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak terapötik moleküller tasarlayarak meme kanserinde ERAD mekanizması inhibisyonuna yönelik tedaviler geliştirmektir.

Özet (Çeviri)

Proteostasis is referred to all protein maintenance processes of the cell. Since protein function emerges from the correct folding, protein quality control (PQC) is essenetial for proteostasis that results in cell survival. Secretory and membrane proteins are targeted to endoplasmic reticulum (ER) for the correct folding. Fully folded proteins are transported from the ER while misfolded/unfolded proteins are retrotranslocated from the ER and targeted to the ubiquitin/proteasome system (UPS) for proteolytic degradation through ER-associated degradation (ERAD) mechanism. Multifunctional BAG-1 protein is the first discovered member of the BAG family. It was identified as the interacting partner of GR which is an essential hormone receptor and anti-apoptotic Bcl-2 in 1995. All six BAG family members consist of common carboxy-terminal BAG domains providing diverse interactions with different protein classes and distinct amino-terminal domains that give differences in functionality. Human BAG-1 protein has three main isoforms called as BAG-1S, BAG-1M and BAG-1L. All isoforms are translated from the same mRNA transcript starting from the different translation initiation regions. BAG-1 isoforms also have common carboxy-terminal regions consisting of BAG domain and ubiquitin-like domain (UbL) and distinct amino-terminal domains leading to the different cellular localization and functions. Yet, the localization of the BAG-1 isoforms could be changed in response to different signals. In addition, BAG-1 is found to be upregulated in different tumor types. BAG-1 has a diverse network of interaction partners such as Hsc70/Hsp70, Bcl-2, NHRs, Raf-1, CHIP and 26S proteasome that implies the essential role of BAG-1 on cellular mechanisms which are protein folding, protein degradation, cell survival, transcription, translation and apoptosis. However, as BAG-1 is one of the NEFs of the Hsc70/Hsp70 chaperone system, it is thought that BAG-1 regulates most of cellular mechanisms in an Hsp70-dependent manner. The BAG-1:Hsp70 interaction occurs between the BAG domain of BAG-1 and nucleotide binding domain (NBD) of Hsp70. On the other hand, BAG-1 is thought to interact with the 26S proteasome via its UbL and therefore provides a link between the protein folding and protein degradation systems and regulates the protein turnover. Preliminary findings in our laboratory had suggested that BAG-1 interacts with proteins in the ERAD mechanism. Given that the Hsp70 chaperone is also one of the ERAD proteins and Hsp70 chaperone system is actively involved in the cell, BAG-1 interactions could occur either dependent or independent of Hsp70. The aim of this study was to investigate the effects of BAG-1:Hsp70 interaction on BAG-1 complexes in EAD mechanism and UPS. For this purpose, point mutations (R205D, R206E and R237D on the BAG domain) were determined which were thought to interrupt the BAG-1:Hsp70 interaction. I82K mutation on the UbL domain was also selected as a domain-control. The point mutations were applied to three-dimensional BAG domain structures obtained from the Protein Data Bank (PDB) and the effects of mutations on BAG-1:protein interactions were investigated in silico via PRISM web server and FoldX software. After the structural analyses, selected mutations were introduced to the N-terminus TAP-tagged BAG-1S sequence by the site directed mutagenesis approach and mutated plasmids were transfected to MCF-7 breast cancer cells. The protein complexes purified by TAP-tag purification method were semi-quantitatively analysed by mass spectrometry in order to identify the interaction partners and determine their amounts. In silico analyses revealed that, point mutations on the BAG domain decreased the stability of BAG-1:Hsp70 interaction. Moreover, BAG domain mutations disrupted the possible BAG-1:VCP/p97 interaction. After the semi-quantitative mass spectrometry analyses, it was observed that the interactions of mutant BAG-1 proteins with Hsp70 chaperone were decreased. On the other hand, R205D mutation disrupted BAG-1:VCP/p97 interaction, while R206E mutation significantly reduced BAG-1:VCP/p97 interaction. According to 20S and 26S proteasome activity measurements of wild type, BAG-1 knockout, mutant and wild type BAG-1S overexpressed MCF-7 breast cancer cells; BAG-1 knockout cells had significantly lower proteasomal activities. Furthermore, R205D and R206E mutations which disrupted/significantly reduced the possible BAG-1:VCP/p97 interaction had also been found to reduce the proteasome activity in a similar manner to the BAG-1 knockout cells. The results suggested that BAG-1 protein is involved in the ERAD mechanism by forming several complexes with chaperones and VCP/p97 which is an AAA+ ATPase and involved in proteasomal targeting. These BAG-1 complexes may participate in targeting and recruitment of the unfolded/misfolded substrates to the proteasome for degradation. Hypotheses emerged from this study will be tested by future studies on functional analyses. The long-term aim is to develop therapeutic molecules in order to disrupt BAG-1:VCP/p97 interaction for the inhibition of ERAD mechanism in breast cancer treatment.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    723988

    Investigating protein variations of Bag-1 in wild type and Bag-1 knockout MCF-7 breast cancer cells

    Doğal tip ve Bag-1 silinmiş MCF-7 meme kanseri hücrelerinde Bag-1'ın protein değişikliklerinin incelenmesi

    PELİN ÖZFİLİZ KILBAŞ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

    PROF. DR. ELİF DAMLA ARISAN

  2. Tez No

    498129

    Meme kanseri hücrelerinde bag-1 ve hsp-70 etkileşiminin incelenmesi

    Investigation of bag-1 and hsp-70 interaction in breast cancer cells

    TUĞBA KIZILBOĞA AKGÜN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. EVREN ÖNAY UÇAR

  3. Tez No

    513333

    Investigation of the localization pattern and the role of anti apoptotic BAG-1 in healthy and tumor tissues from patients with breast carcinoma

    Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik BAG-1 proteininin rolü ve lokalizasyonunun incelenmesi

    JALE YILDIZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

  4. Tez No

    421156

    Effect of potential co-chaperone MZB1 on chaperone Grp94

    Olası koşaperon MZB1 proteininin Grp94 şaperonu üzerindeki etkisi

    MUSTAFA BARBAROS DÜZGÜN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    Biyokimyaİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER

  5. Tez No

    439663

    Studying the role of an anti-apoptotic Bag-1 protein in healthy & tumor tissues in patients with breast carcinoma

    Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik Bag-1 proteinin rolünün çalışılması

    EMİNE ARZU BAŞKALE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY

Geri Dön