Monitoring the ATPase domain dynamics of dnak upon nucleotide binding by using ion mobility mass spectrometry
Dnak ATPase domeninin nükleotid bağlanma dinamiklerinin iyon hareketlilik kütle spektrometresiyle incelenmesi
- Tez No: 535874
- Danışmanlar: DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyofizik, Biyokimya, Biyoteknoloji, Biophysics, Biochemistry, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 79
Özet
Tam olarak katlanmış üç boyutlu yapı, proteinlerin işlevlerini sürdürebilmeleri için elzem bir özelliktir çünkü proteinler hemen hemen her biyolojik süreçte yer alan ve yapı olarak içsel dinamikleri olan moleküllerdir. Protein katlanmalarının tam olarak gerçekleşmediği aksi durumlarda, protein homeostazını sağlamak ve hücrede oluşabilecek zararlı durumların önüne geçebilmek için sorunlu proteinleri ortadan kaldıran moleküler kompleksler bulunur. Ayrıca, moleküler şaperonlar protein katlanmasına ek olarak oligomerik protein yapılarının oluşumunda, substratların hücre içinde taşınmasında ve geri dönüşümü olmayan agregasyon formlarının uzaklaştırılmasında görev alarak hücre içi protein döngüsüne katkıda bulunur. Isı şoku protein ailesi, daha önce tanımlandığı üzere Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 ve küçük Hspler olmak üzere 5 alt sınıftan oluşur. Tüm bu sınıflandırmalara ek olarak, ısı şoku proteinlerinin fonksiyonel çeşitlilik açısından foldazlar, holdazlar ve disagregazlar olarak ayrılan 3 ana sınıf vardır. Holdazların en tipik ve yaygın örneği olan Hsp40, amorf agregatlar, toksik oligomerler ve amiloid fibriller gibi fonksiyonel olmayan proteinlerin oluşumuna neden olan istenmeyen molekül-içi ve moleküller arası etkileşimleri önlemek için ara ürün polipeptit zincirlerini yakalar. Hsp70, nükleotit bağlanma domeni (NBD) ve substrat bağlanma domeni (SBD) arasındaki allosterik etkileşimler sonucu holdaz ve foldaz fonksiyonları arasında geçiş yaptığı için sadece bir kategori ile ilişkilendirilemez. Isı şoku proteini 70 (Hsp70), şaperon ailesinde en çok korunan ve hücre içinde aktif olarak ifade edilen proteinlerden biridir. N-ucunda 45 kDa'lık bir nükleotit bağlanma domeni ve C-ucunda 25 kDa'lık bir substrat bağlama domeni içerir. Memelilerde, 4 farklı 70 kDa ısı şoku proteini bulunur. Bunlar çekirdek ve sitoplazmada bulunduğu kanıtlanan Hsp70 ve Hsc70, mitokondride bulunan mHsp70 ve son olarak ER'da görev alan BiP/GRP78 proteinleridir. Bir Hsp70 işlevi olarak protein katlanmasını düzenleyen allosterik modülasyon, SBD ve NBD arasındaki çift yönlü iletişime dayanır. Ayrıntılı olarak, ATP molekülünün NBD'ye bağlanması, SBD'de substrat yüksek ilgili kapalı-kapak konformasyonundan, substrat düşük ilgili açık-kapak konformasyonuna geçişini uyarır. Diğer yandan, substratın SBD'ye bağlanması, NBD bölgesinin ATPaz aktivitesini indükler. Bu arada, nükleotit değişim faktörleri (NEF'ler) ADP'nin ATP ile değiştirilmesine yardımcı olurken J proteinleri (Hsp40'ler) SBD'ye substrat getiren proteinlerdir. Proteinler, yapısal anlamda sadece statik olarak düşünüldüğünde tam anlamıyla anlaşılamaz, ancak dış ve iç etkileşime bağlı protein dinamikleri de işin içine katıldığında proteinler bir bütün olarak anlaşılabilir. Elektrosprey iyonizasyonu (ESI) ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) gibi yumuşak iyonizasyon tekniklerinin bulunması, molekül içi ve moleküller arası kovalent olmayan etkileşimleri koruyarak biyo moleküllerin gaz fazına transferine olanak sağladı. Tüm bu gelişmeler beraberinde“Özkorunum (Native) Kütle Spektrometresi”teriminin ortaya çıkmasına neden olmuştur. En basit tabiriyle, üç boyutlu yaıpılarını koruyacak şekilde iyonize olmuş moleküllerin gaz fazına geçmesi ile yapılan kütle analizidir. Bu yöntem aynı zamanda protein komplekslerinin alt birimleriyle birlikte stokiyometrik analizine ve birbirleri arasındaki etkileşimin incelenmesinde kullanılmaktadır. İyon hareketliliği kütle spektrometresi (IMMS), zayıf elektrik alanının etkisi altında gazla doldurulmuş drift tüpündeki hareketliliklerine bağlı olarak iyonları ayıran karmaşık bir analitik tekniktir. Moleküllerin drift tüp içersindeki yolculuğu süresince geçirdiği süre ölçülür ve bu süre iyon halinde hareket eden moleküllerin şekil ve büyüklüklerine bağlı olarak ortamı bufferlayan (azot, helyum vs.) gazlarla yaptıkları çarpışmalar ile belirlenir. Bu yüzden iyon hareketliliği kütle spektrometresi, kütle spektrometresine kattığı üçüncü bir boyut (kütle, yük, yapı) ile proteinlerin dinamik yapı ve davranışlarının incelenmesinin önünü açmıştır. Ayrıca, bu çalışmada da üzerinde durulan proteinlerin farklı enerji seviyelerindeki katlı konformasyonlarının tespiti de bu teknik ile yapılabilmektedir. Kütle spektrometresinde kullanılan üç öncü iyon hareketliliği kütle spektrometresi tekniği vardır. Bunlar drift-zaman iyon hareketliliği kütle spektrometresi (DTIMS), hareketli-dalga iyon hareketliliği kütle spektrometresi (TWIMS) ve asimetrik-alan iyon hareketliliği kütle spektrometresi (FAIMS)' dir. Bu çalışmada, iki domen arası köprü vazifesini gören amino asit dizisini içeren ve içermeyen iki farklı NBD'den oluşan DnaK (Hsp70 bakteriyel homoloğu) 388 ve 392 moleküllerinin pH ve kon gerilimi değişimlerine ek olarak ATP bağlanmasının yapısal dinamiklerin üzerindeki etkisinin açıklanması amaçlanmıştır. Burada iyon hareketliliği kütle spektrometresi ve özkorunum (native) kütle spektrometresi kullanılarak DnaK proteinine dışarıdan yapılan etkiler sonucu konformasyonel dağılımlarının nasıl etkilendiği araştırılmıştır. Bu çalışmada elde edilen veriler, DnaK 388 ve 392 molekülleri arasındaki temel farklılık olan NBD ve SBD domenleri arası bir nevi köprü görevi gören amino asit sekansının DnaK'nin konformasyonel dağılımlarını düzenlediğini ve NBD'nin dışarıdan yapılan müdahalelere gösterdiği davranışsal değişiminde görev aldığını göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Fully-folded three-dimensional structure is an inevitably crucial feature for proteins to maintain their functions because proteins are structurally dynamic molecules involved in almost every biological processes. Otherwise, degradation machineries take into place to ensure protein homeostasis. Moreover, the molecular chaperones facilitate protein turnover in different ways in addition to folding, such as oligomeric assembly, transporting substrates and disposal of irreversible aggregates by degradation pathways. The family of heat-shock proteins consists of 5 subclasses which are formerly defined as Hsp60s, Hsp70s, Hsp90s, Hsp100s and small Hsps. In addition, there are 3 major classes, such as foldases, holdases and dissaggregases in terms of heat-shock protein functions. The most typical and widely-known example of holdases is Hsp40 that captures the intermediate polypeptide chains to prevent undesired intramolecular interactions leading to nonfunctional proteins like amorphous aggreagates, toxic oligomers and amyloid fibrils. The Hsp70 cannot be fitted in only one category since it switches between holdase and foldase functions based on allosteric interactions among nucleotide-binding domain (NBD) and substrate-binding domain (SBD). Heat-shock protein 70 kDa (Hsp70) is one of the most conserved and constitutively expressed protein in chaperone families, that comprises an N-terminal nucleotide-binding domain of 45 kDa and a substrate-binding domain of 25 kDa. In mammals, 4 different Hsp70s are defined that Hsp70 and Hsc70 are found in nucleus and cytoplasm; on the other hand, mHsp70 resides in mitochondrial matrix and BiP/GRP78 is localized in endoplasmic reticulum (ER). Allosteric modulation that regulates Hsp70 folding function relies on bidirectional communication between SBD and NBD. In detail, ATP or ADP binding to NBD stimulates the SBD transition from high affinity closed –lid to low affinity open-lid, respectively. On the other hand, binding of substrate to SBD induces ATPase activity of NBD domain. Meanwhile, nucleotide exchange factors (NEFs) help recycling ADP with ATP while J proteins (Hsp40s) present substrate to SBD. Proteins cannot be understood well by considering them just as a static picture, rather they should be considered as dynamic entities with external and internal interactions result in conformational changes that are crucial for their functions. In this study, we aimed to elucidate conformational dynamics of DnaK (bacterial homolog of Hsp70) 388 and 392 constructs which consist of only NBD with/without linker under pH, cone voltage and nucleotide binding perturbations. Herein, ion mobility mass spectrometry and native mass spectrometry had allowed us to survey distributions of the conformational ensembles by disturbing the natural state of DnaK externally. Preliminary data guided us to state that linker region as a major difference between DnaK 388 and 392 molecules modulates the conformational distributions and affects the behavior of NBD under different perturbations that mimic cellular conditions as well.
Benzer Tezler
- Anaplasmosisli keçilerde eritrosit membranı lipit ve protein oksidasyonu ile Na+/K+ATPaz aktivitesinin araştırılması
The investigation of erythrocyte membrane lipid and protein oxidation with Na+/K+ATPase activity in goats anaplasmosis
SALİM İLKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyokimyaVan Yüzüncü Yıl ÜniversitesiVeteriner Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. YETER DEĞER
DR. ÖĞR. ÜYESİ BEKİR OĞUZ
- Yenidoğanın geçici takipnesinde inhale salbutamol tedavisinin etkinliğinin araştırılması
Effect of inhaled salbutamol for the treatment of transient tachypnea of the newborn
DİDEM ARMANGİL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2009
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıHacettepe ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT YURDAKÖK
- STZ-diyabetik sıçanlarda alyuvar membranı ve lipit peroksidasyonu
Erythrocyte membrane and lipid peroxidation in STZ-diabetic rats
Ş. ONUR BOZKURT
- Kıyı çizgisi değişiminin gayrimenkul değerine etkisinin sayısal modellenmesi
Numerical modeling of the effect of shoreline change on real estate value
MEHMET ÜLGER
Doktora
Türkçe
2022
Bilim ve TeknolojiAnkara ÜniversitesiGayrimenkul Geliştirme ve Yönetimi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YEŞİM TANRIVERMİŞ
- Yoğun bakım ünitelerinde yatan hastalarda orofaringeal kolonizasyon gelişimi ve nozokomiyal infeksiyonlarla ilişkisinin izlenmesi
Monitoring the development of oropharyngeal colonization and its relationship with nosocomial infections in intensive care units
RAMAZAN GÖZÜKÜÇÜK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2001
HastanelerSağlık BakanlığıEnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURCAN BAYKAM