Investigation of the localization pattern and the role of anti apoptotic BAG-1 in healthy and tumor tissues from patients with breast carcinoma
Meme kanserli hastalardan alınan sağlıklı ve tümörlü dokularda anti-apoptotik BAG-1 proteininin rolü ve lokalizasyonunun incelenmesi
- Tez No: 513333
- Danışmanlar: DOÇ. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 76
Özet
Meme kanseri, dünyadaki en yaygın ikinci kanserdir ve kadınlarda en sık görülen kanserdir. Daha az gelişmiş bölgelerde, kadınlarda en sık ölüm nedeni ve akciğer kanserinden sonra daha gelişmiş bölgelerde kanser ölümünün ikinci nedenidir. Türkiye'de ise kadınlarda en sık görülen kanser yine meme kanseridir. İmmünohistokimyasal biyobelirteçler östrojen reseptörü, progesteron reseptörü, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Ki-67, hastalığın durumu için tümör derecesi, boyutu ve nodal durumu kombinasyonu ile ilişkili olarak düşünülür. Günümüzde yirmiye yakın meme kanseri türü belirtilmiştir. Fakat bu çalışma için temel olarak, gen ekspresyon profillerine ve moleküler sınıflamaya dayalı olarak tanımlanmış dört alt grup seçilmiştir: Luminal A, luminal B, HER2 pozitif ve üçlü negatif meme kanser tipleri. Östrojen ve progesteron reseptörleri, hücre büyümesi ve proliferasyonunda rol alan steroid hormon reseptörleridir. PR, ligand ile aktifleşen transkripsiyon faktörüdür ve proliferatif sinyal yolağında, sinyal transdüksiyon yolunu aktive eder. Hücrede MAPK yolağının aktivasyonunu indükler. ER, PI3K / AKT sinyalini indükler ve meme kanseri hücrelerinde hücre büyümesini uyarır. Ayrıca dimerize haldeki aktifleşmiş HER2 reseptörü de RAS ve PI3K yollarını fosforile ederek alt yolaklarının aktiflenmesinde rol oynar. Çekirdekte, steroid hormon reseptörleri hormona duyarlı enhancer sekanslarını tanır ve bağlanarak hormone ilişkili transkripsiyonu artırır. Normal meme epitelyumuna kıyasla, ön-invaziv meme hastalıkları ve meme kanserinde Bcl-2 ile ilişkili anthanogen BAG-1 yaygın olarak artmaktadır. Ek olarak, Bag ailesi proteinleri, bir dizi insan kanserinde ve tümör hücre hatlarında, özellikle de lösemi, meme, prostat ve kolon kanserlerinde farklı olarak eksprese eder. BAG ailesi, çok çeşitli hedef moleküller ile etkileşime giren ve apoptozu, proliferasyonu, transkripsiyonu, metastazı, motiliteyi ve otofajiyi düzenleyen çok fonksiyonlu bir protein grubudur. BAG-1 ayrıca Bcl-2'den bağımsız anti-apoptotik etkilere sahiptir. Çok sayıda reseptör tirozin kinazına bağlanır ve apoptozun inhibisyonunda rol alır. Çalışmalar, BAG-1'in erken meme kanseri prognozunda klinik amaçlarla bir biyobelirteç olarak kabul edilebileceğini göstermektedir. Meme kanseri durumunda, BAG-1, AKT, BCL-2, B-RAF ve C-RAF, steroid hormon reseptörleri ve diğer proteinler ile etkileşime giren ısı şok protein HSP70 için bir eş-şaperondur. Öte yandan, ER fonksiyonunu düzenleyerek östrojen bağımlı transkripsiyonu arttırır. BAG-1 ve PR, ER arasındaki ilişkiler konusunda literatürdeki çalışmaların sonuçları değişkenlik göstermektedir. Bu konuyu ele almak için, BAG-1 ve BAG-1 ile ilişkili sağkalım faktörleri, laboratuvarımızda reseptör tipleri farklı meme kanseri hücre hatları ile çalışıdı. Ön çalışmalarımız bizi meme kanseri hücre sağ kalım yolağında BAG-1etkisi üzerine düşünmeye itmiştir. Alternatif translasyon mekanizması ile üretilen BAG-1'in üç izoformu, hücrede çeşitli bölgelerde lokalize haldedir. Hücre içinde farklı lokalize olabilen BAG-1 izoformları fonksiyonel olarak fark gösterir. Tek bir mRNA transkriptinden alternatif translasyon başlangıcı ile, 3 majör ve 1 minör izoform elde edilir. Bütün izoformlar BAG bölgesine sahiptir, fakat BAG-1L'de ve BAG-1M'de nükleer lokalizasyon sinyali bulunur. Böylece, BAG-1L nükleusta yer alır ve BAG-1M de çekirdeğe göç edebilir. BAG-1'in izoformları, lokalize oldukları doku ve hücrelere göre özelleştiği bilinmektedir. Hücre yolaklarınındaki rolü nedeniyle BAG-1, hücre sağkalımını düzenleyerek hastalıklar için önemli bir biyo-belirteç olarak kabul edilir. Apoptotik protein BAD'ın mitokondriyal membranda BCL-2 ve BCL-XL ile dimerize halde bulunmaktadır. Bu dimerizasyon, hücrede BAD aracılı apoptozu teşvik eder. BAD'ın, Ser112 ve Ser136 residülerinin BCL bağlama bölgesinde olduğu düşünülmektedir ve bu residülerinden fosforile olan BAD, mitokondriyal membrana BCL yoluyla bağlanamaz ve sitoplazmada kalır. Sitoplazmik BAD ise bu sayede hücre sağkalımında rolü bilinmektedir. Laboratuvarımızda yapılan önceki çalışmalarda, Bag-1 ve onun etkileşim partnerlerinin hücre sağkalımı ve apoptoz yollarında önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Çalışmalar, meme epitel MCF-10A, tümörijenik MCF-7 ve triple negatif MDA-MB-231 hücre hatları kullanılarak gerçekleştirildi ve p-AKT, BRAF, CRAF, BCL-2 ile BAG-1 etkileşimleri bu çalışmalarca doğrulandı. Ayrıca, etkileşim kompleksinin bir üyesi olan AKT, Ser 136 residüsünden BAD'ı fosforile ettiği, BAD'ın Ser 112 residüsünün ise p-CRAF vasıtasıyla fosforile edildiği de ekibimizin yaptığı çalışmalarca tekrarlandı. Bu iki lokasyondan birisinden fosforile olan BAD'ın, hücre sağkalımını artırmaktadır. Bu, bize meme kanseri hasta dokularında da bu yolakların doğrulamasının yapılabileceği hususunda fikir verdi. Başlangıçta,“Bu yolaklar meme kanserli hasta dokularında doğrulanabilir mi?'' ve ”Hormon reseptörlerine bağlı meme kanserlerinde BAG-1 expresyonu ve ilişkili bu sağkalım yolağı reseptör bağımlı olarak değişkenlik gösterir mi?" soruları ile yola çıkıldı. Bu çalışmada, ER, PR, HER2 bağımlı meme kanserlerinde BAG-1'in ve sağ kalım yolağındaki BAD ilintili faktörlerin ekspresyon paternleri hastaşardan alınan tümörlü ve tümörsüz dokularda incelenmesi amacıyla yola çıkıldı. Bu amaca ulaşmak için BAG-1, BAD, AKT, BRAF, CRAF ve fosforile edilmiş formları ER, PR, HER2 bağımlı farklı tipteki kanser hastalarından alınan normal ve tümörlü meme dokularında araştırıldı. Eşzamanlı olarak, ortak tümör ilişkili genlerdeki mutasyon taraması için, genetic materyal eldesi aynı hastaların kan numunelerinden izole edildi. Bu çalışma, böylelikle hem protein temellli çalışma hem de genetic çalışma yapılarak iki iş akışından oluşmaktadır. Tümör doku örnekleri İstanbul Sağlık Bakanlığı Üniversitesi Ümraniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nde gerçekleştirilen cerrahi işlem sonrası özel saklama solüsyonlarına alındı. Hem normal hem de tümör doku örneklerinin protein izolasyonu hemen yapıldı. Sonrasında immünoblotlama çalışmaları gerçekleştirilmek üzere protein izolasyonları soğuk zinciri bozulmadan kısa süre içerisinde gerçekleştirildi. Ayrıca immünhistokimya çalışmaları ile lokalizasyon çalışmaları yapıldı. Bu deneyleri yapmak için, dokular parafin bloklarına gömüldü. Formalin fiksasyonu yapılan dokular daha sonra ilgili antikorlarla boyanarak ışık mikroskobu altında incelendi. Öte yandan, aynı hastalardan alınan kan örneğinden izole edilen genetik materyal yoluyla major yaygın tümör baskılayıcı ve onkojenik genlerdeki varyasyonları saptamak için NGS çalışmaları gerçekleştirildi. Meme kanserinde yaygın sorumlu olan onkojen ve tümör baskılayıcı genler PCR bazlı çoğaltılarak, ve oligo dizileriyle işaretlenerek her örnek için ayrı ayrı kütüphaneler hazırlandı. Örnek bazlı kütüphaneler sonrasında birleştirilip örnek havuzu sekanslama teknolojisi kullanularak dizilendi. Dizileme cihazından alınan ham data variant çağırma uygulaması kullanılarak sıralandı ve sonrasında çeşitli databaseler ve varyant çağırma toolları kullanılarak potansiyel varyasyonu araştırmak için analiz edildi. Literatürdeki birçok küçük kohortlu çalışmalar, BAG-1'in meme kanserinde farklı sonuçları olan ekspresyonunu sergilemektedir. Araştırmacılar ve klinisyenler, nükleer BAG-1 ekspresyonu ile yüksek sitoplazmik Bag-1 arasındaki sağkalım veya ilişkinin azalması ve sağkalımın iyileştirilmesi gibi birçok farklı sonuca ulaşmışlardır. Ancak östrojen, progesteron, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü ve Bag-1 interaksiyonları önemli bir konu olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, Bag-1, ER ve PR arasındaki ilişkilendirmeler de ihtilaf göstermektedir. Bazı çalışmalar Bag-1 ekspresyonu ile ER veya PR ekspresyonu arasında bir ilişki olmadığını gösterirken, diğer çalışmalar Bag-1 ve ER'nün BAG-1 ve PR ile birlikte ifade eğiliminde artış gösterdiğini ifade etmiştir. Bununla ilgili çelişkiler henüz aydınlanmamıştır. Bu çalışmada protein deneylerini yürütebilmek için 48 farklı hastadan doku örnekleri toplandı. Çalışmadaki ana bulgu, tümörlerde, BAG-1 L aşırı ifadesinin, nükleustaki BAG-1 lokalizasyonununa eşlik etmesidir. Ayrıca bu durum ER ile olan ilişki ile paraleldir. Lumainal A tipinde, BAG-1L, p-AKT ve p-BAD Ser 136 nükleusta lokalizasyonları tekrarlı çalışmalarca tümör dokularında gözlemlenmiştir. Buna bağlı olarak, muhtemel BAG-1, p-AKT, BAD/p-BAD Ser 136 üçlü kompleksinin, ER varlığında nükleer lokalize olabileceği ihtimali üzerinde yoğunlaşılmıştır. Bu bulgu ışığında BAG-1L'nin ER ile ilgili meme tümörlerinde biyobelirteç olma olasılığı üzerinde çalışmalar devam ettirilmektedir.
Özet (Çeviri)
Breast cancer is the second most common cancer in world, and by far the most frequent cancer among women. In less developed region, it is the most frequent reason of death in women, and second cause of cancer death in more developed regions after lung cancer. Besides, in Turkey the most common cancer in women is breast cancer. Immunohistochemical biomarkers oestrogen receptor, progesterone receptor, human epidermal growth factor receptor and Ki-67 are considered with the combination of tumor grade, size, and nodal status for the disease status. Presently, there are 20 major types of breast cancer. However, mainly four subgroups that has been defined clearly based on gene expression profiles and molecular classification were chosen for this study: Luminal A, luminal B, HER2 enriched and triple negative breast cancers. Estrogen and progesterone receptors are steroid hormone receptors that have roles in cell growth and proliferation. PR is ligand activated transcription factor and activate signal transduction pathway in pro-proliferative signalling. It induces the activation of MAPK signalling in cell. ER induces PI3K/AKT signalling and stimulates cell growth in breast cancer cells. Besides, activated HER2 receptor phosphorylates RAS and PI3K pathways also. In nucleus, steroid hormone receptors recognise and bind to hormone responsive enhancer sequences. Bcl-2 associated anthanogene BAG-1 is commonly increased in pre-invasive breast disease and breast cancer compared to normal breast epithelium. In addition, Bag family proteins express differentially in a range of human cancers and tumour cell lines, particularly leukaemia, breast, prostate, and colon cancers. Bag family, a multifunctional group of protein that interacts with a wide range of target molecules and regulate apoptosis, proliferation, transcription, metastasis, motility and autophagy. BAG-1 also has anti-apoptotic effects, which are independent of Bcl-2; it binds to numerous receptor tyrosine kinases and improves their ability to inhibit apoptosis. Studies show that BAG-1 can be accepted as a biomarker for clinical purposes in early breast cancer prognosis. In case of breast cancer, Bag-1 is a co-chaperone for the heat-shock protein HSP70 that interacts AKT, BCL-2, B-RAF and C-RAF, steroid hormone receptors and other proteins. In the other hand, it increases estrogen dependent transcription by regulating ER function. Reported associations between BAG-1 and PR, ER are variable. To address these issues we tried to assess the expression of BAG-1 and BAG-1 related survival factors with cell lines with breast cancer that differ from the receptor type in our laboratory.Our early studies encourage us to enlighten to find out exact role of BAG-1 in survival pathway. Three isoforms of BAG-1 that are generated by alternative translation mechanism are localized various location in the cell. Bag-1 isoforms, which can be differentially localized in the cell, are functionally distinct. Alternative translation initiation from a single mRNA transcript produces 3 major and 1 minor isoform. All isoforms have BAG domain, but nuclear localization signalling is found in BAG-1L and a part of NLS in BAG-1M. Thus, BAG-1L localizes on nucleus and BAG-1M can also be translocated to nucleus. The isoforms of BAG-1 are specialized according to the tissue and cell lines they localized. Because of the involvement in number of cellular pathways, BAG-1 is regarded as an important marker for diseases, regulating cell survival. Apoptotic protein BAD is known that reside in mitochondrial membrane with dimerized with BCL-2 and BCL-XL. This dimerization promotes BAD mediated apoptosis in cell. If BAD is phosphorylated on Ser112 and Ser136 that residues are considered to be in BCL-binding site, phosphorylated BAD unable to bind mitochondrial membrane via BCL and exist cytoplasm. Cytoplasmic BAD promotes cell survival. The previous studies in our lab demonstrated that Bag-1 and its interaction partners have impprtant roles in cell survival and apoptosis pathways. The studies were managed by using tumorigenic MCF-7 and triple-negative MDA-MB-231 and non-tumorigenic MCF-10A epithelial cell lines. In our laboratory, BAG-1 interactions with p-AKT, BRAF, CRAF, BCL-2 was verified. In further, the member of this interaction complex AKT, phosphorylates BAD at Ser 136 residue and Ser 112 residue of BAD is phosphorylated via p-CRAF. The phosphorylated BAD on these two residues promotes cell survival. This work exited us to find these pathways in breast carcinoma patients' tissue. To begin with, we think about that“Are these pathways also present in tissues from breast carcinoma patients?'' and ”How is the situation in breast cancer linked to hormone receptors?'' In this study, it was intended to enlighten hormone receptor and HER2 dependent expression patterns of BAG-1 and survival factors affecting BAD in breast cancer tissues. To achieve this aim, BAG-1, BAD, AKT, BRAF, CRAF and phosphorylated forms were investigated in normal and tumor breast tissues across ER, PR, HER2 status. Simultaneously, proteomic effects if the mutation in common tumor related genes were searched to identify tumor progression for same patients' sample. This study consist of two workflow, one is conducted with tissue sample from patients. Tumor tissue samples were supplied from Univesity of Ministry of Health - Umraniye Training and Research Hospital of Istanbul. Tissues were taken from the lumpectomy, mastectomy surgeons. The fresh tissues were taken into RNA Later solution. Protein isolation of both normal and tumor tissue samples were done immediately. Immunobloting studies were done further. Besides, immunohistochemistry studies were conducted. To make this experiments, tumorous sections of tissues were embedded in paraffin blocks. Formaline fixed parafine embedded tissues then stained with interested antibodies. In the other hand, we conducted NGS study to detect major common tumor suppressor and oncogenic genes variations via the genetic material isolated from the blood sample from the same patients. We conducted to library preparation step via PCR based detection kit for our breast cancer panel. Sequencing was conducted further. Aligned fragments were then analysed to searched the potential variation by using genetic tools. Many small cohort studies in literature have measured expression of BAG-1 with different outcomes in breast cancer. Researchers and clinicians found that many different results such as association between nuclear BAG-1 expression and decreased survival or association between high cytoplasmic Bag-1 and improved survival. However the estrogen, progesterone, human epidermal growth factor receptor and Bag-1 interactions came up as an important issue. Also, described associations between Bag-1, ER and PR are different. Some studies have shown no association between Bag-1 expression and ER or PR expression while other studies have shown that Bag-1 and ER tend to co-express, as do BAG-1 and PR. There are many contradictions about it. Total forty eight tissue samples from different patients were used to make protein experiments in this study. The main finding in this study is that in tumors, BAG-1 L overexpression accompanied by BAG-1 localization in nucleus. Besides, ER positivity is parallel for this relationship. In lumainal A type, BAG-1L, p-AKT and p-BAD Ser 136 resided in nucleus. Depends on the finding, we suggested that possible BAG-1, p-AKT, BAD/p-BAD Ser 136 triple complex might be co-localized in nucleus in the condition of ER presence and BAG-1L could be the main target for the ER-related breast tumors.
Benzer Tezler
- An improved antibody-based method to detect whole genome cytosine methylation in mouse embryonic fibroblasts
Fare embriyonik fibroblastlarında tüm genom sitozin metilasyonunun (5meC, DNA metilasyonu) tespiti için antikor temelli (immün-boyama) bir metodun geliştirilmesi
SELCEN ÇELİK
- Uzun süreli minosiklin uygulamasının ventilasyonun farklı şiddetlerdeki hipoksiye aklimatizasyonu oluşumuna etkisinin spinal kord(C3-C5) bölgesinde araştırılması
Investigation of the effect of LONG-TERM minocyclin application on the formation of hipoxy acclimatization of ventilation in different violations in the spinal cord (C3-C5) region
HALİME BÜŞRA BAĞLITAŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
FizyolojiErciyes ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ KEMAL ERDEM BAŞARAN
- Tiroid tümörlerinde ZIP4, ZO-1 ve claudin-1 ekspresyonunun immünohistokimya ve realtime PCR yöntemleri ile araştırılması
Investigation of the expression of ZİP, ZO-1 and claudin-1 in thyroid tumors by immunohistochemistry and real-time PCR methods
MUSTAFA NACİR
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2020
PatolojiDicle ÜniversitesiTıbbi Patoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ İBRAHİM İBİLOĞLU
- Mesane tümörlü olguların biyopsi örneklerinde sinyal ileti yolaklarının rollerinin araştırılması
The role of signal transducer pathways of the investigation in biopsises of patients with bladder tumors
AYŞE GÜL BAYRAK
- Investigation of combined biological roles of neuraminidase 1 and gm3 synthase enzymes in glycolipid metabolism
Nörominidaz 1 ve gm3 sentaz enzimlerinin glikolipit metabolizmasındaki birleşik biyolojik rolünün araştırılması
MELİKE CAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Moleküler Tıpİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. VOLKAN SEYRANTEPE