Optimization of expression and isolation of a thermophilic p450 enzyme
Bir termofilik p450 enziminin ekspresyonunun ve izolasyonunun optimizasyonu
- Tez No: 536890
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ NUR BAŞAK SÜRMELİ, DOÇ. DR. GÜLŞAH ŞANLI MOHAMED
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 68
Özet
Sitokrom P450 enzimleri (CYP veya P450) hidrokarbonların oksidasyonunu yüksek verimlilik ve seçicilikle katalizleyen ayrıca hidroksilasyon, epoksidasyon, redüksiyon, demetilasyon gibi pek çok reaksiyonu olan monooksijenez enzimleridir. CYP119, Sulfolobus acidocaldarius arkesinden elde edilen asidotermofilik bir P450 enzimidir. CYP119 termofilik özelliği sayesinde ince kimyasalların ve farmasötiklerin üretiminde bir biyokatalizör olarak yaygın bir şekilde kullanılma potansiyeline sahiptir. Ancak tüm bu özelliklerinin yanında CYP119'un üretimi ve saflaştırılması oldukça zor ve zaman alıcıdır. Bu çalışmada, recombinant protein üretimi teknikleri sayesinde termofilik CYP119'un optimum üretimi ve saflaştırılması başarıyla gerçekleştirildi. CYP119 DNA'sına N-terminal ve C-terminal histidin etiketleri klonlandı. Protein ekspresyonu izopropil β-D-l-tiyogalaktopiranosid (İPTG) ile Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde indüklendi. Ayrıca hem biyosentezini artırmak için δ-aminolevülinik asit (ALA) kullanıldı. Üretimi optimize etmek için farklı IPTG ve ALA konsantrasyonları, ekspresyon sıcaklıkları ve süreleri kullanıldı. CYP119, Ni-NTA afinite kolon ile izole edildi ve saflaştırıldı. Saflaştırılan N (N-His-CYP119) ve C (C-His-CYP119) terminal Histidin etiketli CYP119'ların termostabiliteleri doğal yapıdaki CYP119'un (d-CYP119) termostabilitesi ile karşılaştırıldı. CYP119 ve varyantlarının oksidasyon tepkimeleri 25 °C ve 65 °C'de gerçekleştirildi ve karşılaştırıldı. Ayrıca N-His-CYP119'un epoksidasyonu HPLC ile farklı sıcaklıklarda izlendi. Tüm bunların yanı sıra izolasyonu kolaylaştırmak için CYP119' un hem N terminaline hem de C terminaline klonlanan Histidin etiketlerinin termostabiliteye ve aktiviteye olan etkileri araştırıldı. Çalışmanın sonunda CYP119 üretimi için koşullar optimize edildi ve Histidine etiketinin proteinlerin kararlılığında ve fonksiyonlarında değişikliklere yol açtığı bulundu. Bu çalışma sayesinde CYP119 gibi oldukça önemli enzimlerin ilaç ve kimya sanayinde kullanımlarında artış sağlanacak ve protein izolasyonunda sıklıkla kullanılan Histidin etiketleri daha dikkatli kullanılacaktır.
Özet (Çeviri)
Cytochrome P450 enzymes (CYP or P450) are monooxygenases that catalyze the oxidation of hydrocarbons with high efficiency and selectivity, and many other reactions like hydroxylation, epoxidation, reduction, demethylation. CYP119, is a thermophilic P450 from Sulfolobus acidocaldarius. Thanks to thermophilic properties, CYP119 has potential to be widely used as a biocatalyst in production of fine chemicals and pharmaceuticals. However, production and purification of CYP119s is quite difficult and time consuming. Here, through recombinant protein production techniques, the optimum production and purification of heat-tolerant CYP119 has been successfully carried out. N-terminal and C-terminal histidine tags were cloned to CYP119. Protein expression was induced in Escherichia coli BL21 (DE3) cells with isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). δ-aminolevulinic acid (ALA) was also used to increase the heme biosynthesis. Different IPTG and ALA concentrations, expression temperature and duration were used to optimize production. CYP119 was isolated and purified with Ni-NTA affinity column. The thermostability of purified N (N-His-CYP119) and C (C-His-CYP119) terminal His-tagged were compared with wild type CYP119 (Wt-CYP119). Oxidation reaction of CYP119 and variants carried out and compared at 25 °C and 65 °C. Also, epoxidation of styrene was performed with N-His-CYP119 in different temperatures. The effects of histidine tags on stability and activity of the CYP119s were observed. Here, conditions for the production of CYP119 were optimized and the histidine tags were found to cause changes in stability and function of proteins. This project will lead to increase in the production of the important enzyme CYP119, which will increase its utilization in the industry.
Benzer Tezler
- Production of recombinant amylopullulanase enzyme from Thermoanaerobium brockii brockii
Thermoanaerobium brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin rekombinant üretimi
HANDE MUMCU
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
- Metagenomik yaklaşımla elde edilen endoglukanaz enziminin rekombinant ekspresyonu ve karakterizasyonu
Recombinant expression and characterization of a novel endoglucanase enzyme obtained by metagenomics approach
FURKAN ABDULLAH ÇALIŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ EMEL ORDU
DR. GÜNSELİ KURT GÜR
- Isolation and characterization of a novel tyrosinase enzyme from native bacterial straine, production of the enzyme by cloning, characterization of the recombinant enzyme and analysis of its biotechnological applications such as production of l-dopa and melanin
Doğal bakteri suşlarından tirozinaz enzim izolasyonu, karakterizasyonu, üretici genin klonlanması, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve l-dopa ve melanin üretimi gibi biyoteknolojide kullanılabilirliği
EBRAHİM VALİPOUR
Doktora
İngilizce
2015
BiyolojiÇukurova ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BURHAN ARIKAN
- Organik çözgenlere tolerant lipaz üreticisi mikroorganizmaların izolasyonu
Isolation of organic solvent tolerant lipase producing microorganisms
BİLGE HİLAL ÇADIRCI
- Multiplex-PCR based screening and computational modeling of virulence factors and T cell mediated immunity in Helicobacter pylori infections for accurate clinical diagnosis
Helicobacter pylori enfeksiyonlarının doğru klinik tanısı için virülans faktörleri ile T hücreye bağımlı bağışıklığın çoklu-PZT ile taranması ve biyoinformatik modellemesi
SİNEM ÖKTEM OKULLU
Doktora
İngilizce
2017
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYÇA SAYI YAZGAN
PROF. DR. ZÜHTÜ TANIL KOCAGÖZ