Production of recombinant amylopullulanase enzyme from Thermoanaerobium brockii brockii
Thermoanaerobium brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin rekombinant üretimi
- Tez No: 510650
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Günümüzde, elde edilen ürünün verimini arttırması, doğaya bırakılmadan önce gereken zararsızlaştırma basamakları ve ürünler için gerekli ekstra saflaştırma basamaklarına duyulan ihtiyacı ortadan kaldırması ve bu sayede proseslerin daha uygun maliyette, normal şartlarda ve kısa sürede gerçekleştirilebilmesine imkan sağlaması nedeni ile enzimlerin endüstriyel alanda kullanımı giderek artmaktadır. Deterjan, gıda, tekstil gibi büyük endüstriyel alanların yanı sıra, içecek, kağıt, deri, biyo-yakıt ve organik sentezi gibi endüstriyel alanlarda da enzimler sıkça kullanılmaktadır. α-amilazlar endüstride en yaygın kullanılan ve dünyadaki enzim pazarının büyük bir kısmını oluşturan enzimlerdir. Hidrolazlar gurubuna ait olan amilazlar nişasta gibi polisakkaritlerin yapısında bulunan α-1-4 glikozidik bağlarını hidroliz ederek maltoz, maltotrioz, glikoz gibi moleküllerin elde edilmesini sağlarlar. Bir diğer hidrolaz enzimi olan ve özellikle gıda endüstrisinde büyük bir öneme sahip olan nişasta prosesinde α-amilaz ile beraber kullanılan pululanazlar ise α-1-6 glikozidik bağının hidrolizini gerçekleştirerek dallanmış yapıların ortadan kalkmasını sağlarlar. Böylece nişasta prosesi sonunda elde edilen ürünlerin verimi arttırılmış olur. Nişasta dünyada bulunan en temel karbon kaynağıdır. Bu nedenle nişastanın kendisi ve işlenmesi sonucu elde edilen ürünler endüstride, özellikle gıda endüstrisinde, çok yaygın kullanılan hammaddelerdir. Nişastanın yapısındaki amiloz çok sayıda glikoz molekülünün α-(1,4) glikozidik bağ ile birbirine bağlanması sonucu meydana gelen lineer yapı iken, amilopektin isimli dallanmış yapıda, lineer yapı oluşturan α-(1,4) glikozidik bağının yanı sıra α-(1,6) glikozidik bağları da bulunmaktadır. Nişasta prosesi jelatinleştirme, sıvılaştırma ve sakkarifikasyon olmak üzere üç basamaktan oluşmaktadır. Sıvılaştırma ve sakkarifikasyon aşamalarında glikoamilaz, α-amilaz ve pullulanaz enzimleri kullanılmaktadır. Proses sonunda glikoz ve maltoz şurubu elde edilmektedir. Endüstriyel proseslerin verimini arttırmak ve maliyetini düşürmek için her zaman yeni enzimlerin bulunmasına karşı bir talep mevcuttur. Bu nedenle, yüksek sıcaklıkta uzun süre çalışabilen enzimlerin bulunması ve rekombinant olarak yüksek miktarda üretilmesi son yıllarda önem kazanmıştır. Gıda endüstrisi başta olmak üzere, tekstil, deterjan ve bira endüstrisi gibi alanlarda kullanılma potansiyeline sahip olan ve ilerleyen yıllarda daha değerli bir hale gelecek olan amilopullulanaz enzimi belirtilen endüstriyel alanlarda ortak olan nişasta prosesinde kullanıldığında prosesin gelişmesine ve ürün veriminin artmasına yüksek oranda katkı sağlayacaktır. xxiv Tip II pullulanazlar olarak da bilinen amilopullulanazlar bi-fonksiyonel enzimlerdir, hem α-(1,4) hem de α-(1,6) bağının hidrolizini gerçekleştirebilirler, mezofilik ve termofilik organizmalar tarafından üretilirler. Literatürde yer alan çalışmalarda T. thermohydrosulfuricum, T. ethanolicus 39E, G. Thermoleovorans NP33, G. Kaustophilus HTA426, Bacillus sp. KSM-1378, T. saccharolyticum B6A-R1 ve Bacillus sp. XAL601 mikroorganizmaları tarafından üretilen amilopullulanaz enzimlerinin, gen dizileri ve enzim ekspresyonundan sorumlu bu gendeki korunmuş bölgeler belirlenmiş ayrıca enzimin rekombinant üretimi gerçekleştirilmiştir. Korunmuş bölgelerin belirlenmesine ek olarak T. ethanolicus 39E mikroorganizmasının ürettiği amilopullulanaz enzim geninin aktif bölgesinde (α- amilaz katalitik domain) mutasyonlar yapılmış ve aktiviteden sorumlu amino asitler tayin edilmiştir. Proteinin moleküler ağırlığı ve izoelektrik noktası ExPASy programı ile sırasıyla 143, 321 kDa ve 4,62 olarak bulunmuştur. Bu çalışmada Thermoanaerobium brockii brockii organizmasına ait amilopullulanaz enziminin gen (apu) dizisinin belirlenmesi ve elde edilen genin karakterize edilmesi, genin klonlanması, enzimin ekspresyonunun optimize edilmesi ve saflaştırılması amaçlanmıştır. Daha önceki çalışmalarda T. brockii brockii apu geni, tasarlanan bir vektör içerisine aktarılmıştır. Fakat enzimin gen dizisi ve vektör içerisine aktarılırken uygulanan deney koşulları bilinmemektedir. İlk olarak, B. subtilis organizması içinde bulunan bu vektörün saflaştırılması gerçekleştirilmiş ve ilgili geni taşıyan 7.4 kb büyüklüğündeki vektör saf olarak elde edilmiştir. Genin dizisinin belirlenebilmesi için, apu geni içerisinde yer aldığı bilinen 2.2 kb büyüklüğündeki PstI gen parçası kesilerek vektörden çıkartılmış, pUC19 klonlama vektörüne yapıştırılarak E. coli DH5α hücrelerine aktarılmıştır. Pozitif kolonilerin seçilmesi Blue-White tarama yöntemi ile yapılmış ve oluşan beyaz koloniler seçilerek sıvı besiyerinde büyütülmüştür. Kültüre edilen kolonilerden plazmid izolasyonu yapılarak agaroz jelde kontrol edilmiş ve PstI genini içeren pUC19 vektörü tayin edilmiştir. Saflaştırılan plazmid örneği , dizilemeye gönderilmiş ve böylece PstI gen parçasının kısmi gen dizilimi ilk aşamada elde edilmiştir. apu geni büyük bir gen olduğu için genin nükleotid dizisini Sanger dizileme yöntemi ile tek basamakta gerçekleştirmek mümkün değildir. Bu nedenle genin tam nükleotid dizisinin belirlenmesinde Primer Walking metodu kullanılmıştır. Elde edilen kısmi PstI gen dizisine göre çift yönlü olacak şekilde gene özgü primerler tasarlanmış ve dizileme işlemi tekrar gerçekleştirilmiştir. Bütün bir apu gen dizisinin belirlenebilmesi için bu işlem 6 kez tekrar edilmiştir. Gen 3834 bp uzunluğunda ve 1276 amino asitten oluşmaktadır. Gen dizisi belirlendikten sonra α- amilaz katalitik bölgesinde bulunan 5 adet korunmuş bölge (β2, β3, β4, β5 ve β7) , bu bölgelerde yer alan ve aktivitede önemli bir role sahip olan amino asitler (Glu and Asp) belirlenmiştir. Enzimin amino asit dizisi diğer thermoanaerobik organizmaların ürettiği amilopullulanaz amino asit dizileri ile karşılaştırılarak korunmuş bölgeler gösterilmiş ve son olarak enzimin korunmuş domain yapıları (siklodekstrin ve pullulan parçalayan enzimlerin N-ucu, alfa amilaz katalitik domain, amyC domain ve fibronektin tip III domain) şematik olarak gösterilmiştir. Bütün bir gen dizisi belirlenen apu geni ilk olarak gradyan PZR ile 50 °C ve 67° C arasındaki sıcaklıklarda çoğaltılmış ve optimum sıcaklık 66° C olarak belirlenmiştir. Gen, optimize edilen PZR koşullarında uç kısımlarında NotI ve SacI kesim bölgeleri bulunan gen spesifik primerler ile tekrar çoğaltılmış ve bu kesim enzimleri ile kesilerek pET-28a(+) ekspresyon vektörüne yapıştırılmaya hazır hale getirilmiştir. xxv Aynı şekilde pET-28a(+) ekspresyon vektörü NotI ve SacI kesim enzimleri ile kesilmiş ve daha sonra apu geni vektöre yapıştırılarak E. coli C43 hücresine aktarılmıştır. Ekspresyonu optimize etmek için 0,1 0,5 ve 1 mM IPTG konsantrasyonları denenmiştir. İndükleme işlemi her bir IPTG konsantrasyonu için 1, 2 ve 4 saat 37° C 'de gerçekleştirilmiş ve sonuçlar SDS-PAGE ile karşılaştırılmıştır. Bu işlem sonunda herhangi bir indükleme görülememiştir. Optimizasyon deneyi 25° C ve 30° C de 1 mM IPTG konsantrasyonu ve 16 saat inkübasyon süresi ile tekrarlanmıştır. İndükleme sonunda eksprese edilen proteinin hücre içerisinde çözünmez bir küme halinde kaldığı (inclusion body) görülmüştür. Enzim denature koşullarda His-tag saflaştırma yöntemi ile saflaştırılmış, fakat bir sonuç alınamamıştır. Bu problemin üstesinden gelmek için ilgili geni taşıyan ekspresyon vektörü E. coli BL21 hücresine aktarılmıştır. Ekspresyonu optimize etmek için 0,1 0,5 ve 1 mM IPTG konsantrasyonları denenmiş ve indükleme işlemi her bir IPTG konsantrasyonu için 2, 4 , 6 ve 8 saat olarak 37° C 'de gerçekleştirilmiştir. En iyi ekspresyon 0.1 mM IPTG konsantrasyonunda elde edilmiştir. Optimum indükleme süresinin belirlenebilmesi için hücreler 0.1 mM IPTG ile 8 ,12 ,16 ve 24 saat 37° C 'de indüklenmiştir. Bu işlem sonunda optimum indükleme süresi 12 saat olarak belirlenmiştir. Gen başarı ile ifade edildikten sonra His-tag yöntemi ile saflaştırma çalışmaları başlatılmıştır. Saflaştırma işlemi sonrasında, istenilen moleküler ağırlık aralığında aşırı üretilmiş protein gözlemlenirken, beklenen banda ek olarak küçük moleküler ağırlıklara sahip iki adet daha aşırı üretilmiş bant gözlenmiştir. Buna ek olarak Ni- NTA'ya, spesifik olmayan proteinlerin de bağlandığı ve elüsyon sonrası bunlarında istenilen protein ile beraber toplandığı görülmüştür. Elde edilen rekombinant amilopullulanaz enziminin aktif bir şekilde çalışıp çalışmadığı red pullulan içeren poliakrilamit jel ile analiz edilmiştir. Elde edilen zimografi sonuçları enzimin aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Bu sonucu desteklemek için rekombinant enzimi üreten E.coli BL21 hücreleri nişasta ve red pullulan içeren agar platelerde büyütülmüş, koloni oluşumu gerçekleştikten sonra hücreler kloroform ile patlatılarak enzimin aktivite gösterdiği sıcaklıkta 3 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda zon oluşumları gözlemlenmiş ve enzimin E. coli organizmasında rekombinant olarak doğru bir şekilde üretildiği gösterilmiştir.
Özet (Çeviri)
Nowadays, the use of enzymes in the industrial fields which are detergent, food, textile, paper and pulp, beverage, leather, dairy, baking and biofuel industry is increasing since they have many advantages over chemical methods. The most widely used enzyme in industry is α-amylases that hydrolyze α-(1-4) linkage in polysaccharides such as starch. Starch and products produced from starch hydrolysis process are widely used in food industry as raw material or in modified form. . Starch process consists of three steps; gelatinization, liquefaction and saccharification. In liquefaction and saccharification steps, α- amylase, pullulanase and glucoamylase enzymes are used. Amylopullulanase enzyme, which has the potential to be used in fields such as the textile industry, the detergent industry and the beer industry, in particular the food industry, will become more valuable in the coming years. It catalyzes both α-1-4 and α-1-6 glycosidic bond hydrolysis reaction. When it is used in starch hydrolysis process, it will contribute greatly to the development of the process and to the increase of product yield. Industrial processes are often carried out at high temperature so there is always demand for new thermophilic enzymes. Recombinant production of thermophilic enzymes is crucial. Our aim is to determine the gene (apu) sequence of amylopullulanase enzyme belonging to Thermoanaerobium brockii brockii organism and to characterize this gene, cloning of gene and optimize the expression of enzyme and purification. In previous studies, the T. brockii brockii apu gene was transferred into a designed vector. However, the experimental conditions that applied to transfer the apu gene into the vector and the gene sequencing are not clarified. In this study firstly, isolation of this vector in the B. subtilis organism was carried out and the vector carrying the apu gene was obtained as 7.4 kb in size. To determine the genomic sequence, having 2.2 kb length of PstI gene fragment including the apu gene, was excised from the vector, cloned into the pUC19 cloning vector and transferred into E. coli DH5α cells. Positive white colonies were selected by Blue-White screening method and these white colonies were grown in liquid medium. The plasmids were isolated from the cultured colonies, and checked on the agarose gel. The positive plasmid sample was submitted to sequencing so that the partial gene sequence of the PstI gene fragment was obtained in the first step. Since the apu gene is a large gene, it is not possible to perform the gene nucleotide sequence in a single step by the Sanger sequencing method. For this reason, Primer Walking method was used to determine the fulllength nucleotide sequence of apu gene. Gene specific primers were designed as bidirectional with respect to the partial PstI gene sequence obtained and the sequencing process was performed again. This process was repeated 6 times to xxii determine full-length apu gene sequence. The gene is 3834 bp in length and consists of 1276 amino acids. After the gene sequence was obtained, five conserved regions (β2, β3, β4, β5 and β7) in the α-amylase catalytic domain were identified. Also amino acids (Glu and Asp) having an important role in activity in these regions were shown. The amino acid sequence of the enzyme was compared with the amino acid sequences of amylopullulanase produced by other thermoanaerobic organisms using the ClustaW2 tool and the conserved domain structures of the enzyme (N-terminus, alpha amylase catalytic domain, amyC domain and fibronectin type III domain of cyclodextrin and pullulan degrading enzymes) are schematically represented. The molecular weight and pI of the protein were calculated as 143, 321 kDa and 4,62 respectively using the ExPASy tool. The apu gene was first amplified with gradient PCR at temperatures between 50° C and 67 ° C and the optimum temperature was determined as 66 ° C. The gene was again amplified with gene specific primers containing NotI and SacI restriction sites under the optimized PCR conditions and also cut with these restriction enzymes to make them ready to ligate into the pET-28a (+) expression vector. Similarly, the pET-28a (+) expression vector was cut with NotI and SacI restriction enzymes and then the apu gene was ligated into the vector and transferred into the E. coli C43 cell. To optimize expression 0.1, 0.5 and 1 mM IPTG concentrations were applied. Induction was performed for 1, 2 and 4 hours at 37 ° C for each concentration of IPTG and the results were compared with SDS-PAGE. At the end of this process, no induction could be seen. The optimization experiment was repeated at 25 ° C and 30 ° C in the presence of 1 mM of IPTG concentration and incubated for 16 h. Following the induction, the expressed protein appears to be an insoluble cluster in the cell (inclusion body). The enzyme was purified by his-tag purification method on denature conditions, but no results were obtained. To overcome this problem, the relevant expression vector was transferred to E. coli BL21 cells. To optimize expression, 0.1, 0.5 and 1 mM IPTG concentrations were tried and the induction was performed at 37 ° C for 2, 4, 6 and 8 hours for each IPTG concentration. The best expression was obtained at a concentration of 0.1 mM IPTG. Cells were induced in the presence of 0.1 Mm of IPTG for 8, 12, 16, and 24 hours at 37 ° C to determine the optimal induction period. The optimum induction period was defined as 12 hours. After the gene was successfully expressed, the purification process was conducted by using the His-tag method. Purification results shown that expected overexpressed band having 143 kDa molecular weight was obtained but in addition to this, two small overexpressed bands were observed. Also, non-specific binding proteins were observed on elution results. The recombinant amylopullulanase enzyme was analyzed in a polyacrylamide gel containing red pullulan to check having activity or not. The results of the obtained zymogram showed that the enzyme had activity. To support this result, recombinant enzyme-producing E. coli BL21 cells were grown in agar plates containing starch and red pullulan. After colonization, the cells were disrupted by using the chloroform and incubated at the temperature where the enzyme was active for 3 hours. Zone formation was observed at the end of incubation and the successfully recombinant enzyme production in E. coli organism was indicated.
Benzer Tezler
- Biochemical characterisation of truncated amylopullulanase from Thermoanaerobacter brockii brockii
Thermoanaerobacter brockii brockii kaynaklı amilopullulanaz enziminin kesilmiş varyantlarının biyokimyasal karakterizasyonu
AYCAN KAYRAV
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
- Nitrit biyosensörü geliştirilmesi için rekombinant nitrit redüktaz enzimi üretimi
Production of recombinant nitrite reductase enzyme for nitrite biosensor development
HİLAL NİSANUR İBİCİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Çevre MühendisliğiGebze Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELEK ÖZKAN
- Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis
Rekombinant antikor fragmanlarının bakterilerde üretimi ve tıbbi tanıya yönelik geliştirilmesi
İLKAY KOÇER KULOĞLU
Doktora
İngilizce
2021
Kimya MühendisliğiHacettepe ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
PROF. DR. MATTHEW P. DELISA
- Pichia pastoris mayasında alkol dehidrogenaz (ADH3) promotoru ile rekombinant fitaz enzimi üretimi
Production of recombinant phytase enzyme with alcohol dehydrogenase (ADH3) promoter in Pichia pastoris
MERVE HADİMİOĞLU
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Gıda MühendisliğiAkdeniz ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET İNAN
- Rekombinant tümör farklılaşma faktörü üretimi ve meme kanseri hücreleri üzerindeki terapötik etkilerinin araştırılması
Production of recombinant tumor differentiation factor and assessment of its therapeutic effects on breast cancer cells
SÜREYYA MERT SELİMOĞLU