Development and validation of methods for the diagnosis of lung cancer via serological biomarkers
Akciğer kanserinin serolojik biyobelirteçler ile teşhisine yönelik yöntem geliştirilmesi ve doğrulanması
- Tez No: 538366
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ALİ OSMAY GÜRE
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Moleküler Tıp, Onkoloji, Biology, Molecular Medicine, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Akciğer kanseri, KHAK, KHDAK, özel yapım protein mikrodizilim, serum, serolojik, otolog antikor, miRNA, biyobelirteç, ELISA, QCM, ROC, hassaslık, özgüllük, lojistik regresyon, LASSO, qRT-PCR, Lung cancer, SCLC, NSCLC, custom protein array, early diagnosis, serum, serological, autologous antibodies, miRNA, biomarker, ELISA, QCM, ROC, sensitivity, specificity, logistic regression, LASSO, qRT-PCR
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 77
Özet
Yeni tespit edilen kanser vakalarının %10'u akciğer kanseridir. Dahası 2030 için yapılan öngörüler halihazırda artmakta olan akciğer kanseri vakalarının tüm dünyada ve özellikle Türkiye gibi gelişmekte olan ülkelerde daha da artacağını göstermektedir. Şu an en ölümcül kanser tipi olan akciğer kanserinin alt tipleri iki başlık altında toplanır: Küçük Hücreli Akciğer Kanseri (KHAK) ve Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri (KHDAK). KHAK akciğer kanserinin en agresif tipidir. Erken Aşama (EA) hastalıkta tedavi seçenekleri ve ortalama hayatta kalma süreleri daha çok olmasına karşın, KHAK'deki hızlı tümör büyüme hızı ve hastalığın çok hızlı metastaz yapma eğilimi erken teşhisi zorlaştırmaktadır. Benzer şekilde KHDAK'de da Erken Aşama hastalıkta cerrahi operasyon seçeneğinin mümkün olması dolayısıyla hasta hayatta kalma oranı artmaktadır. Fakat şu an tarama ve erken teşhiste kullanılan Bilgisayarlı Tomografi (BT) ve Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) gibi yöntemler verdikleri sonuçlarda yüksek hatalı pozitiflik olması sebebiyle yetersizdir. Ek olarak tümör cinsini tespit ederken histolojik değerlendirmede kullanılan biyopsi yöntemleri hem hasta için invazivdir hem de örnekleme hataları dolayısıyla verdikleri sonuçlar yüksek hatalı negatiflik içerebilmektedir. Bu yüzden teşhiste kullanılmak üzere ucuz, hassas ve invaziv olmayan yöntemlere büyük ihtiyaç bulunmaktadır. Otolog antikorlar kanserin klinik teşhisinden yıllar önce hasta serumunda bolca ve yüksek stabilitede bulunmaktadır. Akciğer kanserinde bu tür antikorların varlığına hem bizim grubumuz hem de diğer bilimsel çevrelerce değinilmiştir. Dolayısıyla otolog antikorların ölçümüne dayalı teşhis yöntemleri akciğer kanserinin erken teşhisinde büyük gelişmeler sağlayabilecek potansiyel içermektedir. Bunun dışında miRNA'lar vücutta yaptıkları hormon benzeri etkiler, serumda sirkülasyonları ve hücrelerdeki düzenleyici etkileriyle akciğer kanserinin erken teşhisinde kullanılabilecek bir diğer adaydır. Bu sebeplerle, çalışmamda labımızda yapılmış cPA çalışmalarının tekrar değerlendirilmesi için güvenilir ve otomatize bir değerlendirme yöntemi geliştirmeyi amaçladım. Ek olarak, daha sonra cPA sonuçlarının doğrulamasında kullanılmak üzere QCM temelli bir immünosensör geliştirmeyi planladım. Son olarak, bunlara paralel bir çalışmada KHDAK'nin erken teşhisinde kullanılmak üzere miRNA temelli biyobelirteç tespit ve doğrulama çalışmaları yapmayı planladım. Aldığım sonuçlar cPA'ların ELISA'ya kıyasla daha iyi hassaslık ve özgünlük değerlerine sahip olabileceğine ve ELISA'ya alternatif olarak QCM-D temelli yöntemlerin geliştirilebileceğine işaret etmektedir. Ayrıca in silico tespit ettiğim miRNA'ların ex vivo validasyonu mümkündür. Labımızda gerçekleştirilen öncül çalışmalarda cPA ile 49 KHAK hastasına ve 50 sağlıklı kontrole ait serumlar taranmış ve sonuçları manuel ve görsel şekilde değerlendirilmişti. Bu çalışmada tek tek otolog antikorların ve bazı otolog antikor panellerinin hassaslık ve özgüllük değerleri hesaplanmıştı. Daha sonra cPA çalışmaları ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Fakat cPA ve ELISA sonuçları arasındaki bazı büyük uyumsuzluklar ve ELISA yöntemi ile alınan ölçümlerin kendi içinde çelişkiler barındırması bu çalışmayla cPA sonuçlarının daha stabil bir yöntemle tekrar değerlendirilmesinde ve otolog antikorları ölçmede ELISA'dan daha başarılı bir yöntem geliştirme çabamda teşvik edici sebep oldu. Bu yüzden AIDA ile cPA tarama görüntülerinden numerik ölçüm değerleri elde edip düşük kalite sinyallerin belli bir eşik değer ile elimine edilmesi sağlandı. Elde edilen veriler kullanılarak çok sayıda ROC eğrisi çizildi. Çizilen tekli otolog antikor ve panel ROC eğrilerindeki artan AUC değerleri uyguladığımız yeni değerlendirme yönteminin başarısı gösterdi. Ayrıca bu çalışmada anti-SOX2 antikorunu PBS solüsyonundan ölçebilen QCM temelli bir biyosensör geliştirildi. Bu yöntemin daha sonra cPA sonuçlarını doğrulamada kullanılması planlanmakta. SOX2 ile anti-SOX2 arasındaki bağlanma etkileşimi QCM standart eğri değerlerinin 1:1 Langmuir İzotermal Bağlanma modeline oturtulmasıyla incelendi. Bunlara paralel ve ek olarak KHDAK'de yüksek riskli kontrollere kıyasla anlamlı şekilde yukarı yönlü değişen miRNA'lar incelendi. Bunun için miRNA ekspresyon datasetleri GEO sitesinden belirlendi. Bunların içinden aynı örnek tipine sahip 2 KHDAK dataseti seçilip bu iki datasette de ekspresyon değerleri anlamlı ve yukarı yönlü değişim gösteren miRNA'lar gerekli analizlerle tespit edildi. Tespit edilen miRNA'lar lojistik regresyon ve LASSO düzenlileştirme yöntemleriyle (Hata metriği: AUC ve MSE) analiz edilip hastaları kontrollerden ayırmada en başırılı olan miRNA paneli seçildi. Seçilen miRNA paneli için qRT-PCR ile doğrulama çalışması yapıldı. cPA görüntülerinden AIDA programıyla elde edilen sayısal değerlerdeki düşük kaliteli verileri başarılı bir şekilde eleyip cPA sonuçlarını tekrar değerlendirebildim. 4 otolog antikordan (FKBP8 – P53 – SOX2 – POLB) oluşan bir panel belirledim. Belirlenen panelin KHAK hastalarını kontrollerden ayırma gücü %100 özgüllükte %60 hassasiyet olarak belirlendi. Bu panel için çizilen ROC eğrilerinin AUC değeri %95.04 olarak hesaplandı. Bahsi geçen panelin teşhis gücü halihazırda piyasada bulunan benzer tek kit olan EarlyCDT-Lung kitinin teşhis gücünün üstünde yer aldı. Anti-SOX2 antikoru ve SOX2 proteini imunojenik çiftini kullanarak PBS solüsyonunda gerçekleştirilen QCM ölçümleriyle bu yöntemin otolog antikorların ölçülmesinde kullanılabilirliği gösterildi. Ön çalışmalar anti-SOX2 mAb QCM yönteminin lineer ölçüm aralığının ELISA ile kıyaslanabilir seviyelerde olduğunu gösterdi. QCM anti-SOX2 yöntemiyle alınan ölçümlerin 1:1 Langmuir Izotermal Bağlanma modeline oturtulmasıyla kullandığım antijen antikor çifti arasında güçlü bir bağlanma etkileşimi tespit edildi. Ayrıca lojistik regresyon ve LASSO düzenlileştirme yöntemiyle KHDAK hastalarını yüksek risk kontrollerden en iyi ayıran 5 miRNA tespit edildi. Fakat, qRT-PCR doğrulama deneylerinde elde edilen düşük Ct değerleri ve serumlarda tespit edilen yüksek hemoliz değerleri dolayısıyla deney sonuçlarından anlamlı çıkarımlar yapmak mümkün olmadı. Dolayısıyla yapılan doğrulama deneylerinin tekrarlanması gerekmektedir.
Özet (Çeviri)
Over 10% of all new cancer cases are lung cancer. Moreover, estimates till 2030 indicate that already increasing lung cancer incidences will keep increasing, especially in developing countries like Turkey. Lung cancer, the leading cause of cancer deaths, has two large divisions: Small Cell Lung Cancer (SCLC) and Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). SCLC is the most aggressive subtype of lung cancer. And although, the treatment options and median survival time is more favorable in Limited Disease (LD), high tumor growth rate and metastatic tendency of SCLC even in the early stages, makes the diagnosis troublesome. Similarly, if NSCLC is diagnosed in early stages, surgery option is open and this increases the patient survival rate. However, current methods in screening and diagnosis, such as computed tomography (CT) and positron emission tomography (PET), are all limited by false positivity rates. Additionally, biopsy methods used in histological evaluations are both invasive and prone to false negativity. Therefore, new diagnostic tools which are cheap, accurate and non-invasive are in high demand. Autologous antibodies are abundantly elicited and stably exist in patient sera years before the clinical diagnosis of disease. Several such antibodies were reported by our group and other groups in lung cancer. Therefore, new diagnostic methods incorporating autologous antibodies can be a huge step forward in early diagnosis of lung cancer. Moreover, miRNAs, with their unique hormone like features such as circulation in serum and their regulatory effects in cell, are another good candidate for the early diagnosis of lung cancer. Therefore, in this study I aimed to develop a reliable, robust and automated evaluation method to re-evaluate custom Protein Array (cPA) screenings previously performed in our lab, and to determine the autologous antibodies with highest discriminatory power between SCLC patients & healthy controls. Moreover, I aimed to develop a Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D) based immunoassay to be incorporated later in the validation of cPA results. Lastly, in a parallel study I aimed to identify and validate novel miRNA biomarkers NSCLC. My results indicate that cPAs can have better sensitivity and specificity than ELISA and that QCM-D can be developed as an alternative to ELISA. miRNAs identified in silico, can also be validated ex vivo. Previously, Protein Arrays (PAs) and cPAs were screened using 49 SCLC patient's and 50 healthy serums in our laboratory, incorporating visual and manual evaluations. Sensitivity and specificity values were calculated for individual autologous-antibodies and a number of autologous-antibody panels. Moreover, validations of cPA results were carried via ELISA. However, large discrepancies between cPA and ELISA results, as well as inconsistencies among ELISA results urged me to consider re-evaluation of cPA results with a more robust way, and to focus on developing a method superior to ELISA in autologous-antibody evaluations. Therefore, I incorporated AIDA to generate numeric values out of cPA screening images and filtered low quality data with optimized cut-off values. Several Receiver Operating Characteristic (ROC) curves were plotted using evaluated data. Improved results were evident by the increased Area Under Curve (AUC) values in both individual and combined ROC curves. Moreover, I developed a QCM based immunosensor for detection of anti-SOX2 antibody to be incorporated later in validation of cPA results. Binding interaction between anti-SOX2 antibody and SOX2 protein was modelled using 1:1 Langmuir Isothermal Binding and standard curves generated in QCM. In a parallel study, I also investigated miRNAs significantly upregulated in NSCLC when compared to high risk controls. For that purpose, miRNA expression datasets were gathered from GEO. Selected 2 datasets with the same sample type were analyzed for common significantly upregulated miRNAs among these two datasets. Significantly upregulated miRNAs were subjected to logistic regression analysis with LASSO regularization (error metrics: AUC and MSE) to select best panel of miRNAs that can distinguish NSCLC patients from healthy controls in given datasets. Moreover, selected miRNAs were analyzed with qRT-PCR to validate the panel. I was able to re-evaluate cPA results by eliminating low quality data from numeric values generated via AIDA software from cPA images. I identified a panel of 4 autologous antibodies (FKBP8 – P53 – SOX2 – POLB) which resulted in 60% sensitivity at 100% specificity in discrimination of SCLC from controls. ROC of this autologous antibody panel had an AUC of 95.04%. Given panel surpassed diagnostic power of the only commercially available diagnostic kit of the same kind; EarlyCDT-Lung. Moreover, proof of concept for measurements of anti-protein antibodies were carried successfully in QCM, using anti-SOX2 antibody-SOX2 protein pair in PBS buffer as an example for it. Early results of anti-SOX2 mAb QCM indicate a linear assay range comparable to ELISA. Langmuir Isothermal Binding model revealed a strong interaction between antibody and protein in our QCM anti-SOX2 measurement experiments. Lastly, I was able to select 5 miRNAs using logistic regression and LASSO regularization that can best discriminate between NSCLC patients and high risk controls. However, validation experiments using qRT-PCR needs to be repeated as low Ct values and prominent hemolysis in serum samples prevented drawing meaningful conclusions.
Benzer Tezler
- Biyomagnetik olaylar
Başlık çevirisi yok
M.TOGAN ÇANDIR
Yüksek Lisans
Türkçe
1996
Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiPROF.DR. İNCİ AKKAY
- Tomografi görüntülerinden akciğer hastalıklarının tespiti amaçlı bir derin öğrenme modelinin geliştirilmesi
Development of deep learning model for detection of lung diseases from tomography images
GÖKHAN KARABAĞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiAkdeniz ÜniversitesiElektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ŞÜKRÜ ÖZEN
- Epileptik nöbet geçiren-sağlıklı çocuğu olan annelerin tükenmişlik düzeylerinin farklı değişkenler açısından incelenmesi
Studying of burnt out levels of mothers of with children having epileptic seizures and healthy children with respect to different variables
SEVİL AKMAN
- Prematüre bebeklerde farklı tanımlama kriterlerine göre bronkopulmoner displazi insidansının, mortalite, morbidite ve uzun dönem prognozunun karşılaştırılması
Comparison of the incidence, mortality, morbidity, and long-term prognosis of bronchopulmonary dysplasia in preterm infants based on different diagnostic criteria
SELİN TUĞÇE KARAHAN YALÇIN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2024
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıSağlık Bilimleri ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. İPEK GÜNEY VARAL
- Akciğer kanserli hastaların idrarlarında uçucu metabolit biyomarkerlerin tayini için analitik yöntem geliştirilmesi
Development of an analytical method for the determination of volatile metabolite biomarkers in urine of lung cancer patients
MERVE GÜL