Covalent immobilization of furanone derivatives for the inhibition of biofilm formation on implant surfaces
İmplant yüzeylerinde biyofilm oluşumunun engellenmesine yönelik furanon türevlerinin kovalent immobilizasyonu
- Tez No: 540208
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL-KARAGÜLER, PROF. DR. MELEK TÜTER
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları, Mikrobiyoloji, Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2018
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 92
Özet
Biyofilm, yüzeye bağlı mikroorganizmalar tarafından oluşturulan, Ekstraselüler Polimer Matriks (EPS) ile çevrelenmiş bir yapıdır. Endüstriyel ve biyomedikal uygulamalarda kontrolsüz ve istenmeyen bölgelerde oluşan biyofilme bağlı hücre agregatları bu uygulamalarda ciddi ekonomik sorunlara neden olmaktadır. Endüstriyel sistemlerde biyofilm oluşumuna, dental yüzeyler, gıda endüstrisindeki üretim bandındaki kontaminasyonlar ve havalandırma sistemleri gibi birbirinden çok farklı sistemlerde sıklıkla karşılaşılmaktadır. Biyofilm oluşumunun insan sağlığı ile ilgili alanlarda yapılan çalışmalar genel olarak su sistemleri, dişçilik, protez ve implantlar üzerine yoğunlaşmaktadır. Biyofilm kaynaklı insan sağlığı problemleri, içme suyu kalitesindeki düşüş ve enerji üretim verimliliği gibi birçok konuda biyofilm oluşumunun verdiği hasarların maliyeti milyar dolarları bulmaktadır. Biyofilm oluşumuna bağlı genel sorunlar toplumlarda ciddi sağlık riski teşkil etmektedir. Hastane ortamına bağlı enfeksiyonlar, mide bağırsak enfeksiyonları, kulak, göz hastalıkları, biyofilme bağlı enfeksiyon risklerinin başında gelmektedir. Hem insan ve toplum sağlığı hem de ekonomik açıdan yaratmış olduğu zararlı etkileri nedeniyle, yüzey üzerinde mikrobiyal birikimi engelleyebilecek veya en azından büyümesini ve yayılmasını durdurabilecek yöntemlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar son yıllarda yoğun olarak yürütülmektedir. Doğada biyofilmi oluşturan mikroorganizmalar, salgıladıkları ekstrasellüler polimer matriks ile sarılıdırlar ve bu matriks, çevresel koşullardaki değişimlere karşı biyofilm yapısı içindeki mikroorganizmaları koruyucu bir katman görevi üstlenmektedir. Aynı zamanda bu katman toksik kimyasalların ve antibiyotiklerin geçişini engelleyerek biyofilm yapısındaki mikroorganizmalara koruyucu bir katman görevi görür. Hücre katmanları arasında bulunan kanallar, biyofilmin gelişmesinde hayati öneme sahiptir. Mikroorganizmalar ihtiyaç duydukları besinlere ve oksijene bu kanallar sayesinde erişirken, atıkların ve ikincil metabolitlerin uzaklaştırılması da yine kanallar ile gerçekleşir. Ayrıca mikroorganizmaların iletişim amaçlı kullandığı sinyal moleküllerinin iletimi bu kanallar üzerinden gerçekleşir. Enfeksiyon riskine karşı biyomedikal alanda biyosidal etkiye sahip antibiyotiklerin uzun süreli kullanımı, zaman içinde patojen mikroorganizmaların bu kimyasallara karşı direnç kazanmasına ve antibiyotiklerin biyofilm oluşumunu engellemede etkisiz kalmasına neden olmaktadır. Biyofilm oluşumunda mikroorganizmalar arasında iletişimi sağlamak amacıyla Açil Homoserin Lakton (AHL), sinyal molekülü olarak kullanılmaktadır. Bu molekül, biyofilmi oluşturan mikroorganizmalarca sentezlenerek hücre dışına salınmaktadır.AHL, diğer mikroorganizmaların hücre duvarında bulunan sinyal reseptörlerince algılanır ve antibiyotik direnç genleri, virülans faktörleri gibi çeşitli genetik elementlerinxxiv ekspresyonunu aktive eder. Bu iletişim sistemi literatürde“Quorum sensing”olarak adlandırılmaktadır. İletişim yolağının bloke edilmesine ise“Quorum quenching”adı verilmektedir ve mikroorganizmaların enfeksiyon ve koloni oluşumunun engellenmesinde hayati öneme sahiptir. Bu çalışmada antibiyotiklerin etki mekanizmasından farklı olarak AHL sinyal yolizinin bloke edilerek, mikroorganizmaların yüzey üzerinde koloni oluşumunun engellenmesi hedeflenmiştir. Sinyal yolizinin ve biyofilm oluşumunun engellenmesi maksadıyla, AHL molekülünün analogları olan halojenlenmiş furanonlar kullanılmıştır. AHL analogları 5-(dibromomethylene)-3-methylfuran-2(5H)-one (FU1 olarak isimlendirildi), 3-(bromomethyl)-5-(dibromomethylene) furan-2(5H)-one (FU2 olarak isimlendirildi), (Z-)-4-Bromo-5-(bromomethylene)-2(5H)-furanone (4Z olarak isimlendirildi), 5-(Bromomethylene)-2(5H)-furanone (2(5H) olarak isimlendirildi) halojenlenmiş furanonlar solüsyon içinde, herhangi bir yüzeye kovalent veya nonkovalent bağ ile bağlı olmadan yapılan çalışmalarda biyofilm oluşumunu engellemede etkin olduklarını göstermişlerdir. Bu çalışmada yüzeye kovalent olarak bağlanan moleküllerin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkisi incelenmiştir. Aynı zamanda yüzeye kovalent bağlı furanonun varlığında antibiyotiklerin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkileri de incelenmiştir. Bu çalışmanın amacı, mikroorganizmaların endüstriyel ve özellikle tıbbi alanlarda sıkça kullanılan yüzeylerde biyofilm oluşumunun engellenmesi için furanon türevleri ile kaplı yüzeyler geliştirmektir. Medikal cihaz ve implant yüzeyleri mikrobiyal kontaminasyona ve buna bağlı enfeksiyon oluşum riski barındırmaktadırlar. Biyofilm engellemesine yönelik bugüne kadar yapılan çalışmalar da dikkate alınarak, yüzey üzerindeki oluşumu engellemek üzere, biyofilm oluşumunda büyük öneme sahip“quorum sensing”sinyal yolizini bloke ettiği bilinen halojenlenmiş furanonların farklı türevleri yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. Solüsyon içinde çözünmüş halde furanon türevlerinin patojen mikroorganizmaların biyofilm oluşumunu engellediği daha önce yapılan çalışmalarda kanıtlanmıştır. Bu çalışmada halojenlenmiş furanon türevlerinin kaplama malzemesi olarak kullanımının, Pseudomonas aeruginosa'nın yüzeye bağlanması üzerine etkisi incelenecektir. Pseudomonas aeruginosa fırsatçı patojeni biyofilm oluşturduğu bilinen ve biyofilm çalışmalarında model olarak kullanılan gram-negatif bir mikroorganizmadır. Geliştirilen yüzeyin, kateter, implant gibi medikal yüzeylerde ve endüstriyel sistemlerde uygulanarak uzun ömürlü koruma sağlanması hedeflenmektedir. Furanon moleküllerinin yüzeye bağlanmasında sol-jel yöntemi kullanılmıştır. SolJel'in serbest hidroksit grubuna karbodiimid reaksiyonu ile poliakrilik asit bağlanmıştır. Azid-nitren reaksiyonu ile yüzey üzerinde furanonun bağlanabileceği serbest nitren grupları oluşturulmuştur. Nitren gruplarına furanon, UV ışık altında fotokimyasal yöntemler kullanılarak bağlanmıştır. Yüzey kimyasında değişim, moleküllerin yüzeye bağlanışı ve yüzey morfolojisi AFM, FTIR ve SEM ile analiz edilmiştir. Bu çalışmada furanon molekülleri başarılı bir şekilde yüzeye kovalent olarak bağlanmıştır. AFM ve SEM çalışmaları ile kaplama çalışmalarındaki her aşamada morfolojik değişim görüntülenmiştir. FTIR çalışmaları ile elde edilen bulgular AFM ve SEM ile elde edilen görüntüleri doğrular niteliktedir. Yüzeye PAA bağlanmasından sonra yüzey pürüzlülüğü 2,059 ± 0,05nm'den 6,821 ± 0,5nm değerine çıkmıştır. Yüzey pürüzlülüğündeki değişim CFU sayımlarını da etkilemiştir. CFU sayımları ve CSLM görüntülemeleri FU1 ve FU2'nin biyofilm oluşumunu engellemedeki etkinliğini doğrular niteliktedir. FU2 molekülünün, FU1'e göre daha etkin olduğu gözlemlenmiştir. AZA bağlı yüzeyle karşılaştırıldığında FU2 bakteriyel bağlanmayı % 76 oranında azaltırken FU1 bağlanmayı % 60 oranında azaltmıştır. 4- Z and 2-5(H) bağlı yüzeylerin biofilm oluşumunu engellemeye yönelik bir etkinliği olmadığı tespit edilmiştir. FU2'nin toplam bakteriyel yükü AZA örneğinden 4 kat SS-SC örneğinden 5 kat daha az olduğu tespit edilmiştir. Tobramisin furanon türevleri ile birlikte kullanıldığında yüzeye bağlı bakteri miktarını tobramisin kullanılmayan örneklerle (FU2 için % 78,9 oranında, FU1 için %65.4 oranında) karşılaştırıldığında FU2 için % 96,7 oranında FU1 için %79,4 oranında azalttığı tespit edilmiştir. Furanon bağlı yüzeyler yabancı cisim enfeksiyon modeli kullanılarak in vivo test edilmiştir. Deney farelerinin % 68'inin 24. saatten önce öldüğü ve furanon kaplı yüzeyler CFU sayımının kontrol yüzeylere göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. eDNA konsantrasyonu ve CFU sayımı arasındaki ilişkiye de bu çalışma ile bakılmıştır ve eDNA miktarının CFU sayımı ile orantılı olarak değiştiği saptanmıştır. Bu proje ITU-Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü ve İtalya'daki Chimica del Riconoscimento Molecolare, CNR, araştırma grubunun işbirliği ile gerçekleştirilmiştir. İtalya'da görevli grup yüzey kaplamalarının ve biofilm örneklerinin ATR-FTIR görüntülenmesinde görev almıştır. Çelik yüzey üzerine kovalent bağlama çalışmaları CNR grubu tarafından yapılmıştır. Arçelik A.Ş. araştırmacılara burs sağlayarak kısmi olarak katkıda bulunmuştur. CSLM deneyleri ve hayvanlarla gerçekleştirilen deneyler Kopenhag Üniversitesi Danimarka'da gerçekleştirilmiştir.
Özet (Çeviri)
A biofilm is essentially composed of microbial cells attached to a surface and completely covered with an extracellular polymeric matrix (EPS) produced by biofilm-forming bacteria. Uncontrollable and undesirable accumulation of cell aggregates constitute serious problems in industrial processes and biomedical applications. Studies concerning biofilm effects on human health are generally performed on water/systems (dentistry systems), prosthesis and implants. Biofilm formation and metabolic activities within may cause serious community health risks. Most of these health risks are nosocomial infections of gastrointestinal, eye and ear etc.Because of these reasons, there is a growing demand for developing strategies to remove and protect the surfaces against biofilm formation . The benefits of biofilm formation to microorganism include increased protection against antimicrobials and defence mechanisms. A biofilm cannot be considered as a homogeneous distribution of cells but it can be thought as a cluster of cells enclosed within a matrix with channels and pores. These channels facilitate the transport of oxygen and nutrients to the biofilm forming units. Removal of waste products and secondary metabolites also occur through these channels. Medical devices and implants are highly susceptible to microbial contamination and infection of biomedical devices is a considerable and increasing problem. The aim of our study is to prevent these infections from the application of a thin coating that prevents bacterial colonization on the surfaces of biomedical devices. The rationale of the study depends on the prevention of microorganism colonization on different surfaces by blocking the communication of these microorganisms through a non-biocidal method. The key molecule of this method is Acyl Homoserine Lactone (AHL), which is a signal molecule used for the communication of microorganisms. These AHL molecules are produced by the microorganisms and secreted out of their cells. These molecules are sensed by other microorganisms and when its density reaches the threshold level, it is taken back to the microorganisms and activates the expression of several genetic elements (virulence factors, antibiotic resistance genes etc.). This communication system is called as“Quorum Sensing”. The blocking of this communication (“Quorum quenching”) is vital to prevent the colonization of microorganisms and infection. In order to achieve this blocking, AHL molecule is the target in our study. Here, analogues of this AHL molecule has been used to block the biofilm formation. Inhibitory effect of AHL analogues 5- (dibromomethylene)-3-methylfuran-2(5H)-one (named as FU1), 3-(bromomethyl)-5- (dibromomethylene) furan-2(5H)-one (named as FU2), (Z-)-4-Bromo-5- (bromomethylene)-2(5H)-furanone (named as 4Z), 5-(Bromomethylene)-2(5H)- furanone (named as 2(5H)) have been examined. Synergistic antimicrobial agent and immobilized AHL analogues composition as inhibitors for adhesion of microorganism have also been investigated.xx Furanone molecules are a part of the chemical defense system produced by marine algae named as Delisea pulchra, which prevents the colonization on their surfaces [1]. Furanones have been found to interfere with quorum sensing mechanism of many human pathogens and in previous works, these compounds and their analogues have been shown to inhibit or prevent the growth of both Gram-negative and Grampositive bacteria [2-4]. These molecules act on intercellular communication system both as free molecules and also as surface immobilized molecules [5]. Natural and synthetic furanone compounds have been found to interfere with Quorum Sensing (QS) mechanism of many human pathogens and block this specific pathway. Thus, the strategy for the present study is covalently linking furanone derivatives on surfaces to assess the effect of the immobilized furanone molecules on the adhesion strength of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Our goal is to inhibit formation of bacterial biofilm especially for medical applications. In the scope of the literature work, the strategy is to coat the surface with halogenated furanone derivatives. To obtain surface-immobilized furanones through the sol-gel processes, carbodiimide chemistry and azide-nitrene chemistry have been carried out. In the literature, the immobilization procedure of furanone molecules starts with amine plasma, following polyacrylic acid and 4-azidoaniline treatment to obtain nitrene groups on to the surface, which will be the linker of furanone under UV light. In this study, furanone molecules have successfully covalently bound to the substrate. Morphological differentiation at each step has been visualised by using AFM and SEM. FTIR results are also coherent with AFM and SEM. PAA attachment has radically increased surface roughness (from 2.059 ± 0.05nm SS-SC to 6.821 ± 0.75) and created niche areas for bacterial attachments. Change in surface morphology also effected CFU counts. CFU counts and CSLM images showed that FU1 and FU2 are highly effective against biofilm formation and FU2 has superior activity compared to FU1. FU2 has inhibited 78.9% of bacterial adhesion onto the surface while FU1 reduced 65.4% when compared the surface without furanone. 4-Z and 2-5(H) have no activity against biofilm formation. The total bacterial reduction is 4 times higher than AZA samples and 5 times higher when compared with uncoated SS-SC samples. Tobramycin asserts antibacterial activity when applied with furanone derivatives and it further reduced attachment of bacteria (96.3% reduction for FU2 and 79.4% reduction for FU1) when compared with tobramycin untreated samples (76% reduction for FU2 and 60% reduction for FU1). Furanone coated substrates were tested in vivo using foreign-body infection model. 68 % mice died before 24th hour of the experiment and furanone coated substrates had higher CFU counts compared to control samples. The relationship between eDNA concentration and CFU also assessed with this experiment and it has been found that eDNA concentration is proportional to CFU count. This project was performed as a collaboration between Istanbul Technical University in Turkey and the research group from Instituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare at CNR (National Research Council) in Italy. Italian group worked on chemical grafting of protease and lysozyme on to the stainless steel coupons and carried out the ATR-FTIR imaging of both the surface coatings and the biofilm samples. Chemically grafted stainless steel surfaces were provided by CNR group.xxi Arcelik A.S. (partner company from industry) also partly contributed to the project by providing scholarships to researchers. CSLM experiments and animal studies were carried at the University of Copenhagen, Denmark.
Benzer Tezler
- Nükleik asit tayinine yönelik elektrokimyasal genosensör dizaynı
An electrochemical genosensor design for detection of nucleic acids
MURAT BOZDAĞ
- Aldehit fonksiyonelitesine sahip polimerik yüzeye antikorların kovalent olarak immobilizasyonu
Covalent immobilization of antibodies on aldehyde-functionalized polymeric surface
MAKBULE PELİN MUHSİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyokimyaMarmara ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SERAP DEMİR
YRD. DOÇ. DR. EMRAH ÇAKMAKÇI
- Katalazın eupergit, florisil ve cam desteklere kovalent olarak immobilizasyonu ve karakterizasyonu
Covalent immobilization of catalase onto eupergit, florisil and glass carriers and characterization of immobilized catalases
ÖZLEM ALPTEKİN
- Covalent immobilization of glucose isomerase on poly (2-hydroxyethyl methacrylate) particles
Glukoz izomeraz enziminin poli (2-hidroksietil metakrilat) tanecikleri üzerine kovalent tutuklanması
ÜMİT HAKAN YILDIZ
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
KimyaOrta Doğu Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NESRİN HASIRCI
- Poli (Metilmetakrilat-ko-Glisidilmetakrilat) hidrojeli kullanılarak beta-galaktosidazın kovalent bağlanma yöntemiyle immobilizasyonu
Covalent immobilization of beta-galatosidase by using poly (Methylmetacrylate-co-Glycidylmethacraylate) hydrogel
GÜL TUNÇ