Mutant proteinlere bağlı endoplazmik retikulum strese cevapta rol oynayan genlerin in vitro analizi
In vitro analysis of genes that involved in response to endoplasmic reticulum stress associated with mutant proteins
- Tez No: 541259
- Danışmanlar: PROF. DR. BURÇAK VURAL, DOÇ. DR. AYŞE EVRİM BAYRAK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Kardiyoloji, Moleküler Tıp, Genetics, Cardiology, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: ER stresi, KatlanmamıĢ Protein Cevabı, AMPK, PRKAG2 Kardiyomiyopatisi, E506K mutasyonu, ER Stress, Unfolded Protein Response, AMPK, PRKAG2 Cardiomyopathy, E506K mutation
- Yıl: 2018
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 90
Özet
Mutant proteinlerin birikmesiyle meydana gelen ER stresinde hücre, IRE1, PERK ve ATF6 proteinlerinin kontrolündeki üç ana yolaktan oluşan katlanmamış protein yanıtı (UPR) adlı sistemini devreye sokmaktadır. Bu çalışmada, PRKAG2 kardiyomiyopatisine sebep olduğu bilinen PRKAG2 genindeki E506K, E506Q ve R531G mutasyonlarının in vitro olarak ER stresi açısından değerlendirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, hem mutant ve normal protein anlatımının yapıldığı hem de ER stres aktivatörü olan Tunikamisin uygulaması yapılmış HEK293 hücre kültüründe UPR yolaklarında rol alan seçilmiş genlerin (BiP, CHOP, GADD34, ATF4, EDEM1, PDIA4, TRAF2, ASK1, XBP1 ve HERP) transkripsiyonel düzeyleri kantitatif RT-PCR (qPZR) yöntemi ile analiz edildi. Doğal-tip ve mutant PRKAG2b transkripti taşıyan hücrelerde IRE1α, PERK, ERO1A ve BiP proteinleri western blot yöntemi ile incelenerek karşılaştırılmaları yapıldı. qPZR analizleri sonucunda, tunikamisin ile oluşturulan ER stresinde GADD34 ve EDEM1 gen ifadelerinde anlamlı bir değişiklik olmadığı, TRAF2 gen ifadesinin azaldığı ve diğerlerinin de arttığı gözlenmiştir. Buna göre her 3 mutant hücrede ise sadece GADD34 ile XBP1 ürünlerinde (us-XBP1 ve t-XBP1) azalmış regülasyon olduğu saptanmıştır. E506Q ve R531G mutant hücrelerde ise HERP, TRAF2 ve EDEM1'in azalmış olarak ifade edildiği belirlenmiştir. Mutant hücrelerin protein analizinde ise E506K mutant hücrelerde, IRE1 ve PERK seviyesi 1.3 kat artmışken (diğer 2 mutant hücrede azalmaktadır) ERO1A ve BiP seviyesi azalmış olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, in vitro deney şartlarında tunikamisin ile hücre kültüründe başarılı şekilde ER stresi oluşturulabilmiştir. Mutant hücrelerde ise doğal-tip hücrelere göre yapılan kıyaslamada belirgin bir ER stresinin oluşmadığı, ancak UPS sisteminin ana yolaklarındaki genlerin hem transkripsiyonel hem de protein düzeylerinde mutasyonun tipine göre farklılıklar oluştuğu gözlenmiştir.
Özet (Çeviri)
In the ER stress due to the accumulation of mutant proteins, the cell activates unfolded protein response system consisting of three main pathways controlled by IRE1, PERK and ATF6 proteins. In this study, we aimed to evaluate E506K, E506Q and R531G mutations in PRKAG2 gene in vitro, which are causing PRKAG2 cardiomyopathy, in terms of ER stress. For this purpose, transcriptional levels of selected genes (BiP, CHOP, GADD34, ATF4, EDEM1, PDIA4, TRAF2, ASK1, XBP1 and HERP) in UPR pathways were analysed by qPCR utilizing HEK293 cell culture, which has both mutant and normal protein expression and treated with ER stress activator tunicamycin. There was no significant change in GADD34 and EDEM1 gene expression, decrease in expression of TRAF2 gene and increase in others. GADD34 and XBP1 products (us-XBP1 and t-XBP1) were decreased in 3 mutant cells. Expression of HERP, TRAF2 and EDEM1 was decreased in E506Q and R531G mutants. IRE1α, PERK, ERO1A and BiP proteins were examined by western blot and compared in cells with wild-type and mutant PRKAG2b transcripts. In protein analysis of mutant cells, IRE1 and PERK levels were increased 1.3-fold (were decreased in other 2 mutants) while ERO1A and BiP levels were decreased in E506K mutants. Consequently, ER stress could be successfully induced in cell culture with tunicamycin. Mutant cells did not show significant ER stress compared to wild-type cells, but there were differences in the transcriptional and protein levels of genes that in the main pathways of UPS system, depending on the type of mutation.
Benzer Tezler
- Genomic analysis of freeze-thaw stress-resistant Saccharomyces cerevisiae
Donma-erime stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin genomik analizi
ÇAĞLA GÜNEY
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
- Investigation of the effects of ATP13A2 mutations on intracellular iron accumulation
ATP13A2 mutasyonlarının hücre içi demir birikimine etkilerinin incelenmesi
EZGİ ERTEREK
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
- Schizosaccharomyces pombe'de endoplazmik retikulum stresinin hücresel etkilerinin araştırılması
Investigation of cellular effects of endoplasmic reticulum stress in Schizosaccharomyces pombe
NEZAHAT GÖKÇE ÖZSAMUR
Yüksek Lisans
Türkçe
2020
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BEDİA PALABIYIK
- Unfolded protein response regulated miRNAs in lipotoxic endoplasmic reticulum stress in macrophages
Makrofajlardaki endoplazmik retikulum stresinde katlanmamış protein yanıtı tarafından düzenlenen miRNAlar
ERDEM MURAT TERZİ
Yüksek Lisans
İngilizce
2014
Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. EBRU ERBAY
- Molecular and functional investigation of disease-associated cytoskeletal proteins protrudin and MYO1H
Hastalık ilişkili sitoskeletal proteinler protrudin ve MYO1H'nin moleküler ve fonksiyonel araştırılması
ECE SELÇUK ŞAHİN
Doktora
İngilizce
2024
Biyolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ