Geri Dön

Genomic analysis of freeze-thaw stress-resistant Saccharomyces cerevisiae

Donma-erime stresine dirençli Saccharomyces cerevisiae'nin genomik analizi

PDF İndir

  1. Tez No: 878667
  2. Yazar: ÇAĞLA GÜNEY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biology, Biotechnology, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 63

Özet

Saccharomyces cerevisiae mayası, tek hücreli, yuvarlak ve tomurcuklanarak üreyen ökaryotik bir mikroorganizmadır. Bu mayanın yaşam döngüsü; eşeyli üreme, eşeysiz üreme ve dinlenme evrelerinden oluşur. Genomu, 1996 yılında tamamen dizilenmiştir ve dizilenme sonucunda 16 kromozom ve yaklaşık 6000 gen belirlenmiştir. S. cerevisiae mayasının ana karbon kaynağı glikozdur. Glikozu, hem fermantasyon hem de oksijenli solunumda kullanmaktadır, fakat oksijenli ortamda glikoz düzeyi yeterli ise fermantasyon da yapmaktadır. S. cerevisiae, endüstride genellikle ekmek mayalamak ve etanol üretmek için kullanıldığından, ekmek mayası ve bira mayası olarak da bilinir. Bu mayaya ait enzimler de biyoyakıt dahil birçok endüstriyel uygulamada sıklıkla kullanılmaktadır. Endüstriyel kullanımının dışında S. cerevisiae, moleküler biyoloji ve genetik alanlarındaki araştırmalarda model organizma olarak da yaygın olarak kullanılır. Genom dizisi uzun süredir bilindiği için ve insan gibi diğer ökaryotlarla homolog genleri olduğu için S. cerevisiae, daha gelişmiş ökaryotları araştırmak için tercih edilen bir model organizmadır. Bu maya türünün diğer avantajları da genetik açıdan kolay manipüle edilebilmesi ve gelişme koşullarının iyi bilinmesidir. S. cerevisiae, genel stres tepkisi veya çevresel stres tepkisi olarak da bilinen bir yolak ile birçok stres türüne karşı hızlı bir cevap oluşturmasıyla da bilinmektedir. Çevresel stres faktörleri ilk uygulandığında, hücre duvarı ve hücre zarına zarar verir. Daha sonra denatüre olmuş proteinler hücre içerisinde yığın oluşturur ve hücrede reaktif oksijen türlerinin arttığı görülür. Bu olaylar sonucunda, hücre organelleri, özellikle endoplazmik retikulum stresi oluşur. Bütün bu hasara karşı, stres sensörleri, önemli sinyal yolaklarını aktive etmek için uyarılar iletir ve stres tepkisi verilir. En sonunda bu stres türlerine karşı direnç kazanmak için stres genlerinin ekspresyonu aktive edilir. S. cerevisiae mayasında yaklaşık 900 genin stres tepkisi ile ilişkili olduğu görülmüştür. Donma-erime stresine karşı direnç, S. cerevisiae mayasında istenilen bir fiziksel stres direncidir. Donma-erime stresi, hücrelerde fizyolojik hasara neden olur. Donma aşaması, buz kristalleri ve hücresel dehidrasyona neden olarak hücreye zarar verir. Erime aşaması da reaktif oksijen türleri üreterek hücreye zarar verir. S. cerevisiae, fırıncılık endüstrisinde bu stres tipine maruz kalır. İlk olarak, hamur, maya ile hazırlanıp dondurularak depo edilir. Daha sonra, donmuş hamur erime aşamasına maruz kalarak pişirilir. Bu aşamalar, mayanın kabarma kapasitesinde düşüşe sebep olur. Bu düşüş cAMP (siklik adenozin monofosfat)-PKA (protein kinaz A) yolağına bağlı olarak gerçekleşir. Glikoz kaynaklı cAMP artışı, PKA'yı da aktive eder. Buna bağlı olarak trehalaz enzimi, mayada stres faktörlerine, özellikle de donma-erime stresine karşı koruyucu olan trehalozu parçalar. Bu nedenle, ekmek üretiminde ve diğer maya biyoproseslerinde verimi arttırmak için donma-erime stresi direncine sahip mayaların geliştirilmesi önemlidir. Metabolik mühendislik, ilk olarak James Bailey tarafından 1991 yılında,“rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak; hücrenin enzimatik, taşıma ve düzenleyici fonksiyonlarının manipülasyonuyla hücresel aktivitelerin iyileştirilmesi”olarak tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, değiştirilmesi istenen hücresel fonksiyonun analiz edilmesi ve bu analiz sonucunda genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak istenilen hücresel fonksiyona sahip bir mikrobiyal suşun geliştirilmesini içerir. Daha sonra, bu suşun istenilen fenotipte olup olmadığına orijinal suş ile karşılaştırılarak karar verilir. Bu klasik ya rasyonel metabolik mühendislik yaklaşımının bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, modifiye edilmesi istenen metabolik yolak veya hücresel aktivitelere ait detaylı bilgi gerekmektedir. Bu sınırlamaların sonucu olarak tersine metabolik mühendislik yaklaşımı geliştirilmiştir. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımında, rasyonel metabolik mühendisliğin aksine ilk adım istenilen fenotipin elde edilmesidir. İkinci adımda, bu fenotipe yol açan genetik yapı ve çevresel faktörler tespit edilir. Belirlenen genetik değişiklik, diğer organizmalarda da bu fenotipi elde etmek için kullanılabilir. Evrimsel mühendislik ise, selektif prosedürler uygulanarak istenilen mikrobiyal fenotiplerin elde edilmesinde kullanılan bir tersine metabolik mühendislik yöntemidir. Mikrobiyal popülasyon, stres gibi bir selektif baskıya maruz bırakıldıktan sonra, popülasyonda doğal yolla mutasyonlar oluşur ve bu popülasyon uygulanan stres gibi selektif koşullara dayanıklı hale gelir. İstenilen fenotipe sahip mikrobiyal suşlar, uygun koşullarda seçilir ve bu fenotipe yol açan mutasyonlar tespit edilir. Genom dizilemesi, canlıların genomunu oluşturan dört nükleotit baz dizisinin belirlenmesi yöntemidir. Yeni nesil dizileme yöntemleri de araştırma, tarım ve sağlık hizmetleri gibi alanlarda sıklıkla kullanılan yöntemlerdir. Sanger dizileme gibi klasik yöntemlere göre daha hızlı olmasıyla bilinen yeni nesil dizileme, çok sayıda örneği aynı anda paralel olarak dizilediği için paralel dizileme/sekanslama olarak da bilinmektedir. Bu dizilemede ilk adım, dizilenecek nükleik asidin organizmadan izole edilmesidir. İzole edilen nükleik asit, ikinci adımda parçalara ayrılarak bir kütüphane oluşturulur. Daha sonra, primerler ve adaptörler eklenir ve farklı platformlar kullanılarak paralel dizileme gerçekleşir. Dizilemesi biten genom, referans genom ile karşılaştırılır ve biyoinformatik analiz araçları yardımıyla mutasyonlar tespit edilir. Bu çalışmada, daha önce elde edilmiş olan, donma-erime stresine dirençli S. cerevisiae mutant suşlarının genomik ve fizyolojik analizi yapıldı. Donma-erime stresine dirençli mutant suşlar, bir tersine metabolik mühendislik yöntemi olan evrimsel mühendislik yöntemi ile kimyasal mutajenez kullanmadan elde edilmiştir. Seleksiyon sonrasında, mutant suşların donma-erime stres direncinin adaptasyon mu yoksa kalıcı bir genomik değişiklikten mi kaynaklandığını anlamak için genetik kararlılık testi yapıldı. Seçilen FT1, FT5, FT6 ve FT9 mutant suşları, genetik olarak kararlı bulundu. Hücre duvarı bütünlüğü, genetik olarak kararlı, donma-erime stresine dirençli FT9 suşuna litikaz duyarlılık testi yapılarak incelendi. Litikaz duyarlılık testinin sonuçları, donma-erime stresine dirençli FT9 mutantının referans suşa (905) göre litikaz ile parçalanmaya, hem stresli hem de stressiz koşullarda daha dirençli olduğunu gösterdi. Donma-erime stresine dirençli FT9 mutantının karşılaştırmalı tüm genom dizileme sonuçları, sadece bir tek nükleotit varyasyonu (SNV) olduğunu gösterdi. Bu varyasyon CDC25 geninde yer alan bir yanlış anlamlı (missense) mutasyondur. Hücre bölünmesi döngüsü proteini kodlayan bu gendeki yanlış anlamlı varyasyon sonucunda, treonin lizin ile yer değiştirmiştir (T1415K). CDC25 geninden üretilen Cdc25 proteini, Ras/cAMP/PKA yolağında Ras2GTP'yi aktive ederek PKA üretimine yol açar. Normal koşullarda, PKA, Msn2 ve Msn 4 gibi stres regülatörlerinin hücre çekirdeğine lokalizasyonunu engellemektedir. CDC25 geninde bulunan ve Ras2GTP aktivasyonuna engel olmaya yol açacak bir bölgede bulunan bu yanlış anlamlı mutasyonun PKA üretimine de engel olması beklenmektedir. Bu nedenle, stres regülatörleri hücre çekirdeğine lokalize olabilecektir. Msn2 ve Msn4, stres koşullarında çekirdeğe lokalize olduklarında, stres genlerinin promotor bölgesinde bulunan stres tepki elementlerine bağlanırlar ve bu genlerin aktivasyonunu sağlarlar. Sonuçta, stres tepkisi verilir ve donma-erime stresine karşı direnç kazanılmış olur. Bugüne dek literatürde, S. cerevisiae mayasının donma-erime stresine karşı direnciyle ilişkili olabilecek birçok gen bulunmuştur, fakat bu dirençle ilgili tüm genler henüz belirlenememiştir. Bu çalışma, CDC25 gen mutasyonunun da S. cerevisiae mayasında donma-erime stres direnci ile ilgili olabileceğini ortaya koymuştur. Sonuç olarak, daha önce evrimsel mühendislik ile kimyasal mutajenez kullanılmadan elde edilmiş olan bir S. cerevisiae mutant suşu, bu çalışmada genomik ve fizyolojik olarak karakterize edilmiştir. Bu analizin sonucunda, donma-erime stresine dirençli mutantta, hücreyi hasara karşı korumak için cAMP/PKA yolağına bağlı değişiklikler gözlemlenmiştir. Donma-erime stresine dirençli FT9 mutant suşunun donma-erime stresine direncinin moleküler yapısını tam olarak anlayabilmek için, gelecek çalışmalar olarak karşılaştırmalı transkriptomik ve metabolik analizlerin de yapılması uygun olacaktır.

Özet (Çeviri)

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a well-known unicellular eukaryotic organism widely used in industry for making bread and for ethanol production. In addition, it is highly used as a eukaryotic model organism for research purposes in molecular biology and genetics. Since its genome sequence is well-known for several years and it has homologous genes with other eukaryotes including humans, S. cerevisiae is used as model organism for studying higher eukaryotic organisms. Additional advantages of S. cerevisiae are its easy manipulation and well-known growth conditions. Freeze-thaw stress is a physical stress type, and freeze-thaw stress resistance is highly desired in S. cerevisiae. Freeze-thaw stress causes physiological damage to cell. Freezing step causes ice crystal formation and cellular dehydration and damages the cell. Thawing step creates damage as a result of ROS formation. S. cerevisiae is faced with this stress type while used in bakery industry. First, the dough prepared with yeast is frozen and stored. Then, the dough is thawed for the baking process. This would cause the drop of gassing power of the yeast. The drop in rising power is due to cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP)-Protein Kinase A (PKA) pathway. There is a glucose-induced increase of cAMP which results in the activation of PKA. Then, trehalase breaks down the trehalose, which is an important component in yeast stress resistance, including resistant to freeze- thaw stress. Thus, freeze-thaw stress resistance is important for improving the efficiency of bread making process and other yeast bioprocesses. In this study, genomic and physiological analysis of previously obtained freeze-thaw stress-resistant S. cerevisiae strains were performed. The freeze-thaw stress-resistant mutant strains were obtained by an inverse metabolic engineering strategy, evolutionary engineering, without using any chemical mutagenesis. After batch selection, genetic stability of the mutants was determined to understand if the resistance to freeze-thaw stress was an adaptation, or it was caused by a permanent genomic change. The selected FT1, FT5, FT6 and FT9 mutant strains were found to be genetically stable. Determination of the cell wall integrity was done using lyticase susceptibility assay. The assay was performed with the genetically stable, freeze-thaw stress-resistant mutant FT9. Results of the lyticase susceptibility assay demonstrated that the freeze-thaw stress-resistant mutant FT9 was resistant to lyticase degradation more than the reference strain (905), under both stress and nonstress conditions. Comparative whole genome sequencing analysis of the freeze-thaw stress-resistant mutant (FT9) revealed only one single nucleotide variation (SNV). The SNV was located on CDC25 gene, and it was a missense SNV. As a result of the missense SNV on this gene encoding a cell division cycle (Cdc) protein, threonine was replaced by lysine (T1415K). In conclusion, a previously obtained freeze-thaw stress-resistant S. cerevisiae evolved strain was characterized in this study at genomic and physiological levels. The results revealed that cAMP/PKA pathway-related changes occurred in the freeze-thaw stress-resistant mutant strain in order to protect it against damage. However, in order to fully comprehend the molecular basis of freeze-thaw stress resistance of this strain, its comparative transcriptomic and metabolic analyses would be necessary as future studies.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    737560

    Comparative whole genome sequencing and bioinformatic analysis of afreeze-thaw stress-resistant, industrial Saccharomyces cerevisiae strain

    Donma-erime stresine dirençli bir endüstriyel Saccharomyces cerevisiae suşunun karşılaştırmalı tüm genom dizileme ve biyoinformatik analizi

    BURCU TUĞBA ŞİMŞEK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    876220

    Chronological lifespan analysis of stress-resistant yeasts

    Strese dirençli mayaların kronolojik yaşam sürelerinin analizi

    ASLI NUR AKAYDIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    807476

    Evolutionary engineering of freeze-thaw stress-resistant yeasts without using chemical mutagenesis

    Donma-erime stresine dirençli mayaların kimyasal mutajen kullanılmadan evrimsel mühendislik ile elde edilmesi

    İREM BALABAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    311952

    Türkiye kaynaklı Salmonella izolatlarının antibiyotik direnç özelliklerinin genomik analizi

    Genomic analysis of antibiotic resistance properties of Salmonella isolates originated from Turkey

    MİNE GÜNEŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA AKÇELİK

  5. Tez No

    316366

    İnsan endojen retrovirus H (HERV-H)'ın genomik analizi

    Genomic analysis of human endogenous retrovirus H (HERV-H)

    MEHRAB GULIYEV

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Genetikİstanbul Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NERMİN GÖZÜKIRMIZI

Geri Dön