Recombinant expression and purification of aquaporins as membrane proteins from halophilic, thermophilic, and cold-adapted microorganisms
Halofilik, termofilik ve soğuk adaptasyonlu mikroorganizmalardan membran proteinleri olarak aquaporinlerin rekombinant ekspresyonu ve saflaştırılması
- Tez No: 922018
- Danışmanlar: PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER, DR. ÖĞR. ÜYESİ NACİYE ESRA ATEŞ GENCELİ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Biochemistry, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 99
Özet
Proteinler, canlı organizmaların hayatta kalabilmesi için temel yapı taşlarıdır. Amino asitlerin belirli bir dizilimle oluşturduğu bu makromoleküller, işlevselliklerini sadece amino asit dizisine değil, aynı zamanda bu dizilerin uzamsal yapısına ve üç boyutlu konfigürasyonuna da borçludur. Proteinler, enzimler, taşıyıcılar, yapısal proteinler, reseptörler ve düzenleyiciler gibi çeşitli türlerde işlevler üstlenir. Enzimler biyokimyasal reaksiyonları hızlandırırken, taşıyıcı proteinler besin ve oksijen taşır. Yapısal proteinler hücresel bütünlüğü korur, reseptörler çevresel sinyalleri algılar ve düzenleyici proteinler hücresel faaliyetleri kontrol eder. Proteinlerin biyoteknolojik uygulamalarda kullanımı, biyolojik sistemlerle uyumları sayesinde büyük bir değer taşır. Biyoteknoloji, doğal biyolojik sistemleri anlamayı ve bu sistemlerden faydalanarak teknolojilere biyolojik çözümler entegre etmeyi amaçlar. Proteinler, çevre dostu çözümler sunarak endüstriyel ve tıbbi alanlarda kullanılmaktadır. Genetik mühendislik ve protein mühendisliği sayesinde bu biyomoleküllerin özellikleri optimize edilebilir, yeni fonksiyonlar kazandırılabilir. Enzim mühendisliği, biyomalzeme üretimi ve biyosensör geliştirme gibi alanlarda proteinlerin sağladığı olanaklar, biyoteknolojinin hızla gelişen ve yenilikçi bir alan olmasını sağlar. Biyoteknolojik uygulamalarda kullanılan proteinlerin sahip olduğu belirli özellikler, hem işlevselliklerini hem de verimliliklerini doğrudan etkiler. Bu durum, biyoteknolojik süreçlerin daha etkili, sürdürülebilir ve çevre dostu olmasına olanak tanır. Endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda, proteinlerin yalnızca yüksek verimle spesifik fonksiyonları yerine getirmeleri beklenmez, aynı zamanda çevresel etmenlere karşı da dayanıklı olmaları gerekmektedir. Bu bağlamda, biyoteknolojik süreçlerde yer alan proteinlerin özelliklerinin optimize edilmesi, proseslerin daha verimli ve uzun ömürlü olmasına katkı sağlar. Özellikle stabilite, dayanıklılık ve fonksiyonel verimlilik gibi özellikler, bu biyomoleküllerin uygulama alanındaki başarısını belirleyen kritik faktörlerdir. Bu özelliklerin iyileştirilmesi, hem maliyetlerin düşürülmesine hem de daha sürdürülebilir çözümler geliştirilmesine olanak tanır. Protein mühendisliği, moleküler biyoloji, biyoinformatik gibi disiplinleri birleştirerek proteinlerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini değiştirmeye yönelik bir yaklaşım sunar. Bu alanda yapılan çalışmalar, doğal proteinlerin işlevselliğini iyileştirmek veya onlara yeni fonksiyonlar kazandırmak için büyük bir potansiyel taşır. Protein mühendisliği ile elde edilen modifikasyonlar, proteinlerin çeşitli çevresel koşullarda daha dayanıklı ve verimli hale gelmesini sağlar. Örneğin, bazı endüstriyel proseslerde kullanılan proteinlerin, yüksek sıcaklık, asidik veya alkali ortamlar, organik çözücüler veya yüksek tuz konsantrasyonları gibi zorlu koşullara dayanıklı olması gerekir. Bu durum, geleneksel protein mühendisliği teknikleriyle çözülebilen bir sorundur. Rekombinant DNA teknolojileri, protein mühendisliğinin temel araçlarından biri olup, proteinlerin istenilen özelliklere sahip olmasını sağlamak için kullanılır. Bu teknolojiler, belirli genetik dizilerin laboratuvar ortamında çoğaltılmasına ve bu genlerin hedef proteinleri üretmesini sağlayacak şekilde tasarlanmasına olanak tanır. Böylece, doğal ortamda bulunan proteinlerin biyoteknolojik uygulamalar için uygunluğunu artırmak mümkündür. Ancak, doğal ortamlarında bulunan proteinlerin her zaman biyoteknolojik uygulamalar için ideal olmadığı durumlar da mevcuttur. Örneğin, bazı proteinler, çevresel stres koşullarına karşı dayanıklı olmayabilir ve bu durum biyoteknolojik süreçlerde verimliliği olumsuz yönde etkileyebilir. Doğal ortamlarda bulunan proteinlerin biyoteknolojik süreçler için uygunluklarını değerlendirmek, bu proteinlerin hangi çevre koşullarında daha verimli çalışacağı hakkında bilgi sunar. Bu bağlamda, aşırı çevre koşullarında hayatta kalabilen ekstremofil mikroorganizmalar, biyoteknolojik süreçlerde kullanılabilecek dayanıklı proteinlerin en önemli kaynaklarından biri haline gelmiştir. Ekstremofiller, yüksek sıcaklık, düşük sıcaklık, yüksek tuz konsantrasyonları, düşük pH seviyeleri ve yüksek asidik ortamlarda hayatta kalabilen mikroorganizmalardır. Bu organizmalar, aşırı çevresel koşullara uyum sağlayarak özel proteinler üretirler. Bu proteinler, biyoteknolojik süreçlerde kullanılabilecek yüksek dayanıklılığa sahip biyomoleküller olarak büyük bir öneme sahiptir. Ancak, ekstremofillerin biyoteknolojik uygulamalarda kullanılması her zaman kolay değildir. Bazı proteinler, doğal ortamlarında yüksek verimle işlev gösterebilirken, endüstriyel koşullarda ihtiyaç duyulan özellikleri sağlamak için ilave modifikasyonlara ihtiyaç duyabilirler. Örneğin, aşırı sıcaklık, tuz, pH veya organik çözücüler gibi koşullar, proteinlerin işlevselliğini olumsuz etkileyebilir. Bu nedenle, biyoteknolojik süreçlerde kullanılan proteinlerin keşfi ve geliştirilmesi, endüstriyel uygulamalarda verimliliği artırmak adına büyük bir gerekliliktir. Sert çevre koşullarına dayanıklı biyomoleküllerin keşfi, biyoteknoloji ve endüstri alanında önemli bir gelişim alanıdır. Bu biyomoleküller, organik çözücüler, yüksek tuz konsantrasyonları, ekstrem pH seviyeleri veya sıcaklıklar gibi zorlu koşullarda işlev gösterebilir ve biyoteknolojik süreçlerin verimliliğini önemli ölçüde artırabilir. Özellikle, enzim mühendisliği, biyosensörler, ilaç geliştirme ve biyomalzeme üretimi gibi alanlarda bu tür biyomoleküllerin kullanımı yenilikçi çözümler geliştirilmesini sağlamaktadır. Ekstremofil mikroorganizmalar ve bu organizmalardan elde edilen proteinler, biyoteknolojik süreçlerde daha dayanıklı ve verimli sistemlerin tasarlanmasına olanak tanımaktadır. Bu nedenle, bu biyomoleküllerin keşfi, optimize edilmesi ve biyoteknolojik uygulamalarda kullanımı, hem bilimsel hem de endüstriyel açıdan büyük bir öneme sahiptir. Araştırma grubumuz, potansiyel biyoteknolojik uygulamalara sahip proteinleri belirlemek amacıyla protein mühendisliği ve metagenomik yaklaşımlar kullanarak çalışmalar yürütmektedir. Çeşitli aşırı çevre koşulları altında yaşayan mikroorganizmalar analiz edilmiş ve yüksek tuz konsantrasyonları, yüksek sıcaklıklar ve soğuk ortamlar gibi zorlu koşullara uyum sağlamış mikroorganizmalar tanımlanmıştır. Bu çalışmalar kapsamında, Virgibacillus sp. AGTR, Türkiye'nin Burdur ilindeki Acıgöl'den yüksek tuz konsantrasyonu bulunan bir ortamdan izole edilmiştir. Geobacillus thermoleovorans ARTRW1, Türkiye'nin Yalova ilindeki Armutlu bölgesindeki sıcak su kaynaklarından elde edilmiştir. Pseudomonas mandelii KGI_MA19 ise Antarktika'daki King George Adası'ndan izole edilmiştir. Membran proteinleri, tüm canlı organizmaların hücrelerinde bulunan ve hücrelerin temel biyolojik işlevlerini yerine getiren büyük bir protein grubudur. Bu proteinler, hücre zarları boyunca çeşitli moleküllerin taşınmasından, hücre içi ve hücreler arası sinyal iletimi gibi geniş bir işlev yelpazesinde kritik roller üstlenir. Hücre zarları, organizmaların çevresiyle etkileşime giren ana yapılar olarak, moleküllerin alınıp atılmasını, iyon dengesinin korunmasını, enerji üretimini ve depolanmasını sağlayan çeşitli mekanizmalar sunar. Membran proteinleri, bu süreçlerin her birinde farklı işlevler üstlenir ve bu sayede hücrelerin hayati süreçlerini sürdürebilmesi mümkün olur. Taşıma fonksiyonları, moleküllerin zarlar boyunca seçici bir şekilde taşınmasını sağlayarak hücre içindeki çevreyi düzenler. Bu taşıma, proteinlerin taşıyıcı veya kanallar olarak görev yaptığı özel mekanizmalarla gerçekleştirilir. Bunlar arasında, özellikle aquaporinler, su moleküllerinin seçici ve kontrollü bir şekilde hücre zarlarından geçmesini sağlayan önemli membran proteinleridir. Aquaporinler, hücrelerin su dengesinin korunmasına yardımcı olan önemli proteinlerdir ve biyolojik süreçlerde suyun hızla taşınabilmesi için hayati bir role sahiptir. Su, hücreler için temel bir bileşen olmasının yanı sıra, birçok biyokimyasal süreç için de gereklidir. Aquaporinlerin suyu hızla ve kontrollü bir şekilde taşıması, hücrelerin su dengesini sürekli olarak düzenlemesine olanak tanır. Su arıtımı gibi biyomimetik membran teknolojilerinde, aquaporinlerin kullanımı geleneksel membran teknolojilerine kıyasla önemli avantajlar sunar. Aquaporin bazlı membranlar, yüksek seçiciliğe ve geçirgenliğe sahip olmaları nedeniyle, geleneksel yöntemlere göre çok daha verimli bir su geçişi sağlar. Bu, su arıtma sistemlerinin daha verimli ve enerji dostu hale gelmesini sağlar, bu da özellikle endüstriyel ölçekte su arıtma uygulamalarında büyük bir tasarruf anlamına gelir. Biyomimetik membran teknolojileri, doğadaki mekanizmaları taklit ederek geliştirilmiş sistemlerdir ve aquaporinlerin kullanımı bu alanda önemli bir gelişim sağlamaktadır. Ancak, su arıtımı ve diğer biyoteknolojik uygulamalarda aquaporinlerin verimliliğini artırmaya yönelik optimizasyon süreçleri, hala araştırmaların yoğunlaştığı bir alandır. Bu optimizasyonlar, aquaporinlerin daha dayanıklı ve uzun ömürlü olmasını sağlamayı amaçlar. Geleneksel çevresel koşullardan elde edilen aquaporinler, belirli sınırlamalara sahip olabilir. Bu nedenle, ekstrem koşullara adapte olmuş mikroorganizmaların aquaporinleri, biyomimetik membran araştırmalarında büyük bir ilgi görmektedir. Bu mikroorganizmalar, aşırı sıcaklık, yüksek tuz konsantrasyonları, düşük sıcaklıklar gibi zorlu çevresel faktörlere dayanıklı aquaporinler üretebilirler. Bu tür ekstremofil organizmalar, biyoteknolojik süreçlerin karşılaştığı zorlu koşullarda işlev görebilecek ve uzun süre dayanabilen membran sistemlerinin tasarlanmasına olanak tanır. Ekstremofil aquaporinler, biyomimetik membranların hem verimliliğini hem de dayanıklılığını önemli ölçüde artırabilir, böylece biyoteknolojik uygulamalarda daha sürdürülebilir ve etkili çözümler sunar. Ekstremofil mikroorganizmaların üretmiş olduğu aquaporinler, biyoteknolojik süreçlerin karşılaştığı ekstrem koşullara dayanıklı, verimli ve uzun ömürlü membran sistemlerinin geliştirilmesine büyük katkı sağlamaktadır. Bu tür biyomoleküller, su arıtımından enerji üretimine kadar geniş bir uygulama alanına sahiptir. Su arıtımı dışında, enerji üretimi, biyosensörler, ilaç tasarımı ve biyomalzeme üretimi gibi birçok biyoteknolojik alanda da bu tür biyomoleküllerin kullanımı büyük bir potansiyel taşımaktadır. Bu alandaki yenilikçi yaklaşımlar, gelecekte daha dayanıklı ve uzun ömürlü membran teknolojilerinin geliştirilmesine olanak tanıyacak ve biyoteknolojinin geleceğinde önemli bir rol oynayacaktır. Ekstremofil aquaporinler, biyoteknolojik süreçlerdeki çevresel koşulların zorluğuna karşı dayanıklı çözümler sunarak, hem ekonomik hem de çevresel sürdürülebilirlik açısından büyük bir potansiyel taşır. Bu tez kapsamında, araştırma grubumuz tarafından izole edilen halofilik, termofilik ve soğuk-adapte mikroorganizmalardan elde edilen aquaporinler incelenmiştir. Membran proteinlerinin rekombinant üretimi genellikle zorlayıcı olduğundan, çalışmamızda bu proteinlerin ekspresyonu, üretimi ve saflaştırılması üzerine odaklanılmıştır. Ekspresyon sorunlarını aşmak için farklı plazmid sistemleri ile hücre dışı ekspresyon gibi çeşitli stratejiler uygulanmıştır. pET28a(+), pIVEX ve pET42b(+) plazmidleri, yukarıda bahsedilen üç mikroorganizmanın aquaporin genlerini ifade etmek amacıyla kullanılmıştır. Halofilik ve termofilik mikroorganizmaların aquaporinlerinin hücre bazlı ve hücre dışı yöntemlerle ekspresyonları yeşil floresan protein (GFP) ile belirlenmiştir. Ekspresyon doğrulandıktan sonra, yüksek hacimli hücre kültürleri kullanılarak protein üretimi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, termofilik, soğuk-adapte ve mezofilik mikroorganizmalardan elde edilen aquaporinlerin deterjan taraması ile çözünürlük koşulları optimize edilmiştir. Foscholine-12 deterjanı, oda sıcaklığında üç saat boyunca uygulandığında, membran proteinlerinin çözünürlük açısından en iyi sonucu verdiği belirlenmiştir. Çözünürlük sağlandıktan sonra, Geobacillus thermoleovorans ARTRW1 ve Pseudomonas mandelii KGI_MA19 aquaporinleri, nikel afinite jeli kullanılarak afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. His-tag taşıyan aquaporinlerin monomerik ve polimerik formları Western analizi ile doğrulanmıştır. Termofilik aquaporinin karakterizasyonu, DOPC lipidlerine entegre edilerek gerçekleştirilmiştir. Aquaporin bazlı proteolipozomlar su moleküllerinin transferi açısından incelenmiş ve proteolipozomların su transfer hızının kontrol lipozomlarına kıyasla 26 kat arttığı tespit edilmiştir. Bu bulgular, aquaporin bazlı biyomimetik membranların su arıtımı gibi endüstriyel uygulamalardaki potansiyel kullanım alanlarını desteklemektedir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar, aquaporin içeren proteolipozomların biyomimetik membran üretimindeki potansiyel uygulamalarını araştırmak amacıyla yürütülmüştür. Farklı çevresel koşullardan izole edilen aquaporinler, biyomimetik membranlar aracılığıyla su arıtımında kullanılabilecek alternatif biyomoleküller olarak değerlendirilmiştir. Bu bağlamda, bu aquaporinlerin rekombinant üretimi ve daha ileri karakterizasyon çalışmaları, gelecekteki araştırmalar için büyük önem taşımaktadır.
Özet (Çeviri)
Proteins are naturally produced biomolecules that have a vital role in living organisms to implement fundamental biological reactions, which enable the cells to sustain their life. Proteins have a wide range of classifications in terms of structural and functional properties. They can participate in metabolic activities, energy production, stress tolerance mechanisms, environmental adaptation, mobility, signal transduction, regulation, transportation, and nutrient uptake from the environment of the cell. As biotechnological approaches try to mimic nature in favor of modern technologies, proteins have been one of the most studied biological molecules. They are used as natural microworkers for biotechnology, exploiting their role outside their original place. Since they are naturally produced, applications manipulating proteins are considered environmentally friendly. They are safe to handle as opposed to synthetic catalysts, which can reach toxic levels during reaction. The suitability of a protein for biotechnological applications depends on the conditions in which it will be utilized. For industrial use, specific functional properties may be essential to ensure its effectiveness. These expectations in biomimetic approaches direct researchers to look for proteins with desired properties, making them resilient to implement expected functions. For this purpose, protein engineering, in which desired properties are gained via molecular biological techniques, has been studied. On the other hand, further investigation into naturally occurring proteins to determine whether nature itself endowed the protein with these properties has also been ongoing. These efforts have been intensely focused on microorganisms that can live in extreme conditions. Although a moderate environment can harbor a large number of life forms, it might not be an excellent alternative source of naturally occurring biomolecules. Most biotechnological applications require extreme conditions where a biomolecule is exposed to a harsh environment in the working place. In our group, we investigate such proteins in terms of potential applications, conducting both protein engineering and metagenomic approaches. Along with different harsh conditions, we identified microorganisms from extreme environments such as high salt concentrations, high temperatures, and cold environments. Utilizing metagenomic approaches, Virgibacillus sp. AGTR was isolated and identified from a high salt concentration environment, Acıgöl (Burdur, Türkiye); Geobacillus thermoleovorans ARTRW1 was isolated and identified from hot spring water, Armutlu (Yalova, Türkiye); and Pseudomonas mandelii KGI_MA19 was isolated and identified from King George Island (Antarctica).Membrane proteins comprise a wide range of proteins found in all kingdoms. They play significant roles such as transport, signal transduction, structural support, cell-to-cell communication, enzymatic activity, energy production, and storage. In particular, aquaporins, as membrane proteins, have been studied for biomimetic membrane technologies in water treatment. Several studies have been conducted to form aquaporin-based biomimetic membranes. Besides the aquaporins of microorganisms from moderate environments, those from extreme conditions have also been investigated for biomimetic membranes. In the present thesis, aquaporins from halophilic, thermophilic, and cold-adaptive microorganisms identified by our group were studied. As the recombinant expression of membrane proteins presents difficulties in expression and purification, we focused on the expression, production, and purification of these proteins. Different strategies, such as cell-free expression in different plasmid systems, were tested to overcome these expression obstacles. The pET28a(+), pIVEX, and pET42b(+) plasmids were used for different aquaporin genes of the three microorganisms mentioned above. The expression of aquaporins from halophilic and thermophilic microorganisms through cell-free and cell-based methods was determined using green fluorescent protein (GFP). After confirming the expression of aquaporins, a high volume of cell culture was used to produce the protein. Then, aquaporins from thermophilic, cold-adaptive, and mesophilic microorganisms were subjected to detergent screening to optimize the conditions and detergents used to solubilize the aquaporin. Foscholine-12 detergent treatment for three hours at room temperature was determined as the optimum condition for membrane protein solubilization. After solubilization, aquaporins from Geobacillus thermoleovorans ARTRW1 and Pseudomonas mandelii KGI_MA19 were purified using affinity gel chromatography with nickel affinity gel. Then, the His-tagged aquaporins were also observed via Western analysis in monomeric and polymeric forms. The characterization of the thermophilic aquaporin was performed by integrating it into DOPC lipids. Aquaporin-based proteoliposomes were examined in terms of water molecule transfer. The transfer rate of proteoliposomes increased 26-fold compared to the control liposome. In this thesis, novel and promising aquaporins were investigated to explore potential applications for biomimetic membrane production using aquaporin-based proteoliposomes. As these aquaporins were isolated from different environmental conditions, they have potential applications in various industrial conditions in water treatment, such as desalination using aquaporin-based biomimetic membranes. In that sense, the recombinant production of these aquaporins is crucial for further studies.
Benzer Tezler
- Recombinant production and characterization of aquaporin protein isolated from geobacillus thermoleovorans ARTR1 and virgibacillus sp. agtr strains
Vırgıbacıllus sp. agtr, geobacıllus thermoleovorans ARTR1 suşlarından izole edilen akuaporin proteininin rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
ŞEVVAL UYSALCAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DR. ÖĞR. ÜYESİ NACİYE ESRA ATEŞ GENCELİ
- İnsan plasental ribonükleaz inhibitörünün heterolog ekspresyonu ve saflaştırılması
Heterologous expression and purification of human placental ribonuclease inhibitor
ÖZNUR CAN
Doktora
Türkçe
2021
BiyokimyaTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA GEDİKLİ
- Expression and purification of recombinant MPT64 protein in escherichia coli for skin test
Deri testi için escherichia coli bakterisinde recombinant MPT64 proteininin ifadesi ve saflaştırılması
ECE AKSOY
Yüksek Lisans
İngilizce
2021
BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar ÜniversitesiMedikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ERKAN MOZİOĞLU
PROF. DR. ZÜHTÜ TANIL KOCAGÖZ
- Probiyotik Bifidobacterium breve 'nin bağışıklık düzenleyici tır proteinin tanımlanması, klonlanması ve rekombinant üretimi
Identification, cloning and recombinant expression of immune modulatory tir protein from probiotic Bifidobacterium breve
DİCLE DİLARA AKPINAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Gıda MühendisliğiEge ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BURCU KAPLAN TÜRKÖZ
- Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo'nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Production, propagation and differentiation of hematopoetic cells producing, purification and characterization of epo and tpo as medical biotechnological product
DUYGU DÜZGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN