Inhibition of HBsAg with stable transfection of Anti-HBsAg recombinant antibody in PLC/PRF/5 cell line
Anti-HBsAg rekombinant antikorunun stabil transfeksiyonu ile PLC/PRF/5 hücre hattinda HBsAg'nin inhibisyonu
- Tez No: 563382
- Danışmanlar: PROF. DR. TAMER YAĞCI, DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Hepatit B, Hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), Tek zincirli değişken fragmanı (scFv), HBsAg inhibisyonu, Hepatitis B, Hepatitis B surface antigen (HBsAg), Single chain variable fragment (scFv), inhibition of HBsAg
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 101
Özet
Karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinom gelişme riski yüksek olan kronik HBV taşıyıcılarının dünya popülasyonunda görülme sıklığı yaklaşık % 3,5'tir. HBV infektifine karşı geliştirilen etkili tedaviler olsa da, sorun devam etmektedir. Bu çalışmanın temel amacı, faj görüntüleme teknolojisine sahip Hepatit B yüzey antijenine (HBsAg) özgü Lig7 tek zincirli değişken fragmanının (scFv) terapötik kapasitesini belirlemektir. İlk önce anti-HBsAg Lig7'nin HBsAg'ye western blot ve ELISA ile bağlanma kapasitesini, HBsAg'nin güçlü bir üreticisi olan PLC/PRF/5 hücre hattını kullanarak değerlendirdik. Daha sonra scFv Lig7 sekansı içeren pIRES2 AcGFP1 vektörünü PLC/PRF/5 hücre hattına aktardık. Floresans mikroskobu altında GFP1 proteini ekspresyonu yoluyla transfeksiyon etkinliği gözlendi. HBsAg seviyelerinde belirgin bir düşüşe rağmen, Lig7 scFV Western blot ve ELISA deneylerinde zorlukla saptanabildi. Alternatif olarak, Lig7 scFV, HBsAg kaplı ELISA plakalarında inkübe edildi ve daha sonra bir tespit sistemi olarak protein L-HRP kullanıldı. Bu yaklaşım, ELISA ile Lig7 scFv'yi başarıyla tespit etmemizi sağlamıştır. Daha sonra, Lig7'nin stabilitesini arttırmak için, insan IgG sabit fragmanını (CH2CH3) scFv Lig7 fragmanına bağladık ve ligasyon verimliliğini PCR ile kontrol ettik. Lig7_Fc fragmanı pBI-CMV1 vektörüne klonlandı ve füzyon antikoru için beklenen bant boyutu bir agaroz jeli üzerinde tespit edildi. Daha sonra, Lig7_Fc füzyon dizisini taşıyan pBI-CMV1 plazmid vektörü CHO-K1 hücre hattına transfekte edildi ve Lig7_Fc protein ekspresyonu ELISA ile belirlendi. Bu nedenle, sırasıyla scFv Lig7 ve Lig7_Fc'nin tespiti için iki ELISA sistemi geliştirilmiştir. Sonuç olarak, çalışmalarımız rekombinant scFv Lig7 antikorunun HBsAg'ye başarılı bir şekilde bağlandığını ve Lig7_Fc ve scFv Lig7'nin gelecekte HBV'nin ortadan kaldırılmasında terapötik ajanlar olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Prevalence of chronic HBV infection is approximately 3.5% worldwide, and affected people are at high risk for the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Despite the availability of effective treatments for HBV infection, there is still a need for curing chronic HBV disease. The main goal of this study is to determine the therapeutic capacity of the Lig7 single chain variable fragment (scFv), which is specific for Hepatitis B surface Antigen. We first assessed the binding capacity of anti-HBsAg Lig7 to HBsAg with western blot and ELISA by using PLC/PRF/5 cell line, which is a strong producer of HBsAg. Next, we transfected pIRES2 AcGFP1 vector containing scFv Lig7 sequence into PLC/PRF/5 cell line. Transfection efficiency was observed through expression of GFP1 protein under the fluorescence microscopy. Despite the apparent decrease in HBsAg levels, Lig7 scFV was barely detectable in Western blotting and ELISA assays. Alternatively, Lig7 scFV was incubated in HBsAg coated ELISA plates and then protein L-HRP was used as a detection system. This approach allowed us to successfully detect Lig7 scFv by ELISA. Then, in order to increase the stability of Lig7, we ligated the human IgG constant fragment (CH2CH3) to the scFv Lig7 fragment, and checked the ligation efficiency by PCR. The Lig7_Fc fragment was cloned into PBI-CMV1 vector, and the expected band size for fusion antibody was detected on an agarose gel. Then, pBI-CMV1 plasmid vector carrying Lig7_Fc fusion sequence was transfected into CHO-K1 cell line, and Lig7_Fc protein expression was determined by ELISA. Therefore, two ELISA systems were developed for the detection of scFv Lig7 and Lig7_Fc, respectively. In conclusion, our studies demonstrated that the recombinant scFv Lig7 antibody binds successfully to HBsAg, and Lig7_Fc and scFv Lig7 can be used as therapeutic agents in the future for the elimination of HBV.
Benzer Tezler
- Development and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment
Kanser tedavisine yönelik antianjiogenik rekombinant antikor yapılarının geliştirilmesi ve yapısal tayini
MELİS DENİZCİ ÖNCÜ
Doktora
İngilizce
2022
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR
- Anti-TNF kullanan HBsAg(-) anti-HBc(+) hastalarda hepatit Byönetiminin değerlendirilmesi
Başlık çevirisi yok
MİTHAT MIZRAK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2019
GastroenterolojiErciyes Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA ALPER YURCİ
- Kronik hepatit b hastalarında vitamin d düzeylerinin değerlendirilmesi
Evaluation of vitamin d levels in chronic hepatitis b patients
FATMA MERAL İNCE
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2016
Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon HastalıklarıDicle ÜniversitesiEnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MUSTAFA KEMAL ÇELEN
- Lamivudin tedavisi sırasında gelişen ve adefovir dipivoksil tedavisine çapraz direnç gösteren yeni bir mutasyon paterni
A novel mutation pattern developed during lamivudine treatment shows cross resistance to adefovir dipivoxil treatment
ERSİN KARATAYLI
Yüksek Lisans
Türkçe
2005
Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıAnkara ÜniversitesiTemel Hepatoloji Ana Bilim Dalı
PROF.DR. MİTHAT BOZDAYI
- Tirozin kinaz inhibitörü verilen kronik myeloid lösemi olgularında HBV serolojisi ve reaktivasyonunun retrospektif değerlendirilmesi
Hepatitis B serology and reactivation in patients with chronic myeloid leukemia given tyrosine kinase inhibitor
İLYAS GÜNDÜZ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2020
Hematolojiİnönü Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİN KAYA