KCNQ1 geni CRISPR/CAS9 sistemi ile düzenlenmiş insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin karakterizasyonu
Characterization of crispr/CAS9 edited kcnq1 gene variants in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
- Tez No: 575418
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ESRA ÇAĞAVİ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Tıbbi Biyoloji, Genetics, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Medipol Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 113
Özet
Kalp ritim bozukluklarından klinikte sıklıkla rastlanan kalıtımsal Uzun QT (UQT) sendromu, hastaya özgü uyarılmış pluripotent kök (UPK) hücre kökenli kardiyomiyositler kullanılarak in vitro modellenebilmektedir. UQT sendromu Tip 1 tanısı konulmuş hastalardan ürettiğimiz UPK hücrelerinde var olan heterozigot KCNQ1 c.965 C/T gen mutasyonu CRISPR sistemi ile vahşi tip alele laboratuvarımızda çevrilmiştir. Tez kapsamında, CRISPR/Cas9 genom düzenleme sonrası homolog olmayan uçların birleşmesini esas alan DNA tamir mekanizması ile düzenlenen 3 farklı KCNQ1 delesyon varyantı TA klonlama yöntemi ile ayrıştırıldı. Yeni gelişen mutasyonların ikisi KCNQ1 protein sekansında çerçeve kaymasına sebep olurken, bir varyantta erken durdurucu kodon oluşturduğu ön görüldü. CRISPR ile düzenlenen ve köken aldıkları sağlıklı ile mutant UPK hücrelerinden elde edilen kardiyomiyositler, moleküler ve elektrofizyolojik olarak incelendi. KCNQ1 varyantlarına sahip olan kardiyomiyositlerin farklılaşma süreçlerinde, ürettikleri gen ve protein miktarlarında sağlıklı hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Yapılan Ca+2'a bağlı Fluo-4 görüntüleme analizlerinde, hastalarda gözlenen QT aralığındaki uzamaya benzer olarak mutant KCNQ1 geni ifade edilen kardiyomiyositlerin kasılma-gevşeme mesafesinin sağlıklı kardiyomiyositlere göre uzadığı gözlendi. KCNQ1 kanal modülatörü ML277 ve JNJ303, sağlıklı, mutant ve genetik olarak düzenlenmiş hücrelerde uygulanarak elektrofizyolojik etkileri incelendi. Gelecek çalışmalarda oluşturulan bu in vitro modelde ve farklı iyon kanalı mutasyonuna sahip kardiyomiyositlerde farklı ilaçlar ve dozları incelenebilir. Böylece ilaç moleküllerinin klinikte UQT sendromunun tedavisine yönelik yeni uygulamalar geliştirilebilir ve hastalık mekanizması detaylı incelenebilir.
Özet (Çeviri)
Hereditary Long QT (LQT) syndrome is frequently encountered in the clinic and it causes cardiac rhythm disorders. LQT syndrome can be modelled in vitro using patient specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived cardiomyocytes. Genome editing studies were performed by targeting the heterozygous c.965 C/T mutation in KCNQ1 gene of iPSCs obtained from patients diagnosed with Long QT (LQT) syndrome type 1. After genetic modification by CRISPR/Cas9 system, random deletions were detected in 3 different variants of iPSCs which edited DNA repair mechanism by NHEJ. Heterozygous sequences generated after genome editing were separated by TA subcloning. Newly developed mutations were shown to cause frame shifts in the KCNQ1 protein sequences while producing an early stop codon in one variant. Cardiomyocytes obtained from CRISPR-edited cells and from healthy and mutant iPSCs were examined at the molecular and electrophysiological level. In the differentiation processes of cardiomyocytes with KCNQ1 variants, there was no statistically significant difference in expression of cardiac specific genes and proteins when compared to healthy cells. However, in electrophysiological analyses, the QT interval of cardiomyocytes with mutant KCNQ1 gene were found to be longer than healthy cells similar to the clinical phenotype. Several drug candidates allosterically interacting with KCNQ1 protein, such as ML277 and JNJ303, have been studied for therapeutic potential in genome-edited iPSCs derived cardiomyocytes. In the future studies, therapeutic application can be screened in the in vitro platform developed in this study that has various forms KCNQ1 mutations. This way, disease mechanism can be explored in greater detail and new drug candidates can be developed.
Benzer Tezler
- KCNQ1 gen mutasyonlarının sınıflandırılmasına yönelik dokuz insiliko aracının tahmin doğruluğunun değerlendirilmesi
Assessment of predictive accuracy of nine in silico tools for the classification of KCNQ1 mutations
ALI AZIMZADE
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiÜsküdar ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ AYLA ARSLAN
- Melatoninin deneysel hipertansiyon oluşturulan erkek sıçanlarda KCNQ, KCNH2 gen ekspresyonları ile QT süresi üzerine etkileri
The effects of melatonin on KCNQ, KCNH2 gene expression and QT duration in exprerimantally hypertensive male rats
MEHMET AKİF OVALI
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
FizyolojiÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. METEHAN UZUN
- Nonsendromik konjenital işitme kayıplarıyla ilişkili gen mutasyonlarının DNA mikroarray tekniği ile incelenmesi
The analysis of gene mutations associated with non-syndromic congenital hearing loss by DNA microarray techni̇que
TURGUT ÇELİK
Tıpta Uzmanlık
İngilizce
2018
Kulak Burun ve BoğazSelçuk ÜniversitesiKulak Burun Boğaz Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BAHAR ÇOLPAN
- İdyopatik jeneralize epilepsi sendromlarında KCNQ2 polimorfizminin araştırılması
Analysis of KCNQ2 polymorphism in idiopathic generalized epilepsy syndromes
KADRİYE AĞAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2001
NörolojiMarmara ÜniversitesiNöroloji Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. CANAN AYKUT (BİNGÖL)
- İki farklı lipid metabolizması indikatörüne KCNQ geninin yok edilmesinin etkisinin araştırılması
Investigation of the effect of destruction of KCNQ gene in TWO different lipid metabolism indicators
GÖKHAN BİLGİN
Doktora
Türkçe
2020
Tıbbi BiyolojiAtatürk ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATİH AKDEMİR