Geri Dön

Modeling the linker movement of the dynein motor protein at atomic resolution

Dinein motor proteinin kuvvet kolu hareketinin atomik çözünürlükte modellenmesi.

PDF İndir

  1. Tez No: 612877
  2. Yazar: MERT GÖLCÜK
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ MERT GÜR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyofizik, Biophysics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 71

Özet

Ökaryotik hücrelerin sağlıklı bir şekilde çalışabilmesi için hücre içi ulaşım ve organizasyon son derece önemlidir. Hücre içi ulaşım ve organizasyon, hücrenin mikrotübülleri (MT'leri) ve aktin filamentleri üzerinde yürüyen motor protein aileleri tarafından gerçekleştirilir. Motor protein ailelerinin yapılarında, bağlandıkları sitozolik yollarda, sitozolik yollar üzerindeki hareket doğrultularında ve taşıdıkları kargolarda farklılıklar bulunmaktadır. Motor proteinleri üç aileye ayrılmaktadır; miyozinler, kinezinler ve dineinler. Miyozinler, aktin filamentleri üzerinde + veya – uca doğru hareket edebilirler. Benzer şekilde, kinezinler de MT'ler üzerinde + veya – yöne doğru hareket edebilirler. Dineinler ise MT'ler üzerinde – yöne doğru hareket ederler. Miyozin ailesi birçok alt aileye sahiptir. Miyozinler, farklı hücre tiplerinde ve organlarda bulunabilirler. Miyozin ailesinin genel olarak yapıları incelendiğinde 1000-2000 amino asit uzunluğunda oldukları görülmektedir. Bu yapılar 3 bölgeye ayrılır; evrimsel olarak korunmuş olan baş yapısı ATPaz aktivitesine sahip olup myozinlerin hareketinden ve aktinlere bağlanmasından sorumludur, boyun bölgesi ise baş bölgesi ile kuyruk bölgesini bağlar. Ayrıca, düzenleyici proteinlerin bağlanması için bir bölgedir. Bu bölge hafif zincir bölgesi olarak adlandırılır, kuyruk yapısı ise yüklerin bağlanması ve myozinlerin dimerizasyon ve oligomerizasyonlarından sorumludur. Dineinler, AAA + (çeşitli hücresel Aktiviteler ile İlişkili ATPazlar) ailesinin üyesidir ve genellikle iki ana alt aileye ayrılır: aksonemal ve sitoplazmik dynein. Aksonemal dinein alt ailesi, flagella ve silianın vuruş hareketinden sorumludur. Sitoplazmik dinein alt familyası ise, taşıma, yönlendirilmiş hücre hareketi, mitoz bölünme ve hücre polarizasyonundan sorumludur Sitoplazmik dinein hücre içindeki birçok yollakla etkileşime girer. Dineinler, kümelenmiş proteinleri, transkripsiyon faktörlerini, mRNA içeren partikülleri, virüsleri, fagozomları, endoplazmik retikulumdan (ER) golgiye geçen vezikülleri, lipit damlacıklarını, lizozomları, melanozomları, peroksizomları, mitokondriyi ve endozomları çekirdeğe doğru taşıdığı bilinmektedir. Nöronlarda, dinein hücre gövdesine retrograd taşınımını yönlendirir ve nöronal göç, büyüme ve sinaps oluşumu için gereklidir. Sitoplazmik dineinlerin fonksiyonunda görülen bozuklukların/aksaklıkların, amyotrofik lateral skleroz, Charcot-Marie- Tooth, Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi birçok nörodejeneratif hastalıklar, lizensefali ve primer silyer diskinezi ile ilişkili olduğu ortaya konulmuştur. Bu belirtilen hastalıklar ile gösterdiği yakın ilişki sebebiyle özelikle tedavi açısından bakıldığında, sitoplazmik dinein motor proteininin nasıl çalıştığının anlaşılması ve çalışırken ne tür fonksiyonel aksaklıkların hastalığa sebep olduğunun belirlenmesi son derece önemlidir. Tıbbi önemlerine ek olarak, dineinler sahip oldukları özgün yapısal organizasyon sebebiyle nanoteknoloji uygulamalar yönünden ve alanında son derece önemli bir yere sahiptir. Protein mühendisliği uygulanarak yapısında gerçekleştirilecek değişikliklerle dineinler bir bütün olarak veya parçalar halinde nanoteknolojik uygulamalarda kullanılması son yıllarda önemli derecede ilgi çekmeye başlamış bir alan olmuştur. Dineinler hücre içerisinde iki ağır zincir ve bunlara bağlı küçük peptidlerle dimer halde bulunmaktadır. Dinein ağır zinciri C-terminali motor bölgesi ve N-terminali kuyruk bölgesinden oluşur. Motor bölgesi kafa, sap ve MT bağlanma bölgesinden oluşur. Kafa bölgesi 6 adet AAA+ (AAA1-6)'dan oluşan heksamerik bir halka oluşturur ve bu halkadan 4 adet uzantı çıkmaktadır; kuvvet kolu, sap, payanda ve C-terminal bölgesi. Halka oluşumu AAA ailesinin üyelerinde ortak özelliktir, bu halka oluşumu AAA alt ailesinin protomerleri toplandığında meydana gelir. Miyozinler ve kinesinler ağır zincirlerinde sadece bir ATP bağlanma bölgesine sahipken, dineinlerin baş bölgesindeki AAA bölgelerinin ilk dördü (AAA 1-4) korunmuş Walker A (P-halka (fosfat bağlanma halkası) bölgesi) nedeniyle ATP'yi bağlayabilir ve katalitik aktiviteye sahiptir. AAA1 bölgesi, ATP'nin bağlanmasından ve ATP'nin hareketlilik için güç üretmek üzere hidrolize edilmesinden sorumludur; AAA1 rolünden farklı olarak, AAA3 bölgesi, ATP'nin hidrolize olması nedeniyle AAA1 ve kuvvet kolu arasında yapısal değişiklikler ileten bir düzenleme anahtarı gibi çalışır. Dinein MTBD alanı, kafaya, 10-15 nm uzunluğunda, anti paralel sarmal-sarmal sapla bağlanır. Dinein mekanokimyasal çevrimi AAA1 bölgesi, kuvvet kolu ve sap arasındaki koordinasyonu gerektirir. Hareketlilikten sorumlu olan AAA1 bölgesinin nükleotit durumu çevrim için önemlidir. Bu nedenle, AAA1 bölgesinin apo, ATP, ADP olarak 3 farklı nükleotit durumuna sahiptir. Dinein sapı, kafa ve dinein MT bağlanma bölgesi arasında iletişimi gerçekleştirmektedir. Bu iletişim, sapın yapısal hareketi ile sağlanır. Sap α ve β olmak üzere iki yapıda bulunabilir; α yapısında dinein MT bağlanma bölgesi yoluyla MT'ye kuvvetli bir şekilde bağlanırken, β yapısındayken dinein MT'ye bağlı değildir. Dinein kuvvet kolu, dinein mekanokimyasal çevrimi sırasında düz ve bükük yapılar arasında geçiş oalcak şekilde konformasyonel değişime uğrar. Kuvvet kolunun düz yapısında pre: güç stroku öncesi, bükük yapısına ise post: güç stroku sonrası yapılar denilmektedir. Kuvvet kolu bükük yapıda iken, N-terminali AAA2-AAA3 ile temas ettiği yerdedir. Kuvvet kolu düz yapıda iken ise N-terminali AAA4'te veya AAA5'te bulunur. Dineinin AAA1 bölgesinde herhangi bir nükleotid bağlı olmadığı durumda kuvvet kolu AAA5'te, ADP bağlı iken ise AAA4'te bulunur. Dinein motorunun mekanokimyasal çevrimi en az beş farklı termodinamik hal ile (TH1-5) tanımlanabilir. Dinein termodinamik halini tanımlamak için 3 parametre kullanılacaktır. Bunlar AAA1'in nükleotid durumu, sap yapısı ve kuvvet kolunun yapısı olarak sıralanmaktadır. İlk termodinamik halinde (TH1); dinein AAA1 bölgesi Apo durumunda, sap α yapısında ve kuvvet kolu ise düz yapıdadır. (TH1: Apo, α, post). Daha sonra, ATP dineinin AAA1 bölgesine bağlanmakta, dinein MT'den ayrılmakta ve sap α yapısından β yapısına geçmektedir. Bunların sonucunda dinein ikinci termodinamik hale geçmektedir (TH2: ATP, β, post). Ardından, AAA1 bölgesinde ATP hidrolizi başlamaktadır ve kuvvet kolu bükük yapıya geçmektedir. Böylelikle dinein 3. termodinamik hale geçmektedir (TH3: ADP.Pi, β, pre). Daha sonra, dynein MT'ye tekrar bağlanmakta, sap α yapısına geri dönmekte ve AAA1 bölgesinden fosfat salınmaktadır. Bunun sonucunda dinein 4. Termodinamik hale geçmektedir. (TH4: ADP, α, pre). Daha sonra, kuvvet kolu bükük yapıdan düz yapıya doğru hareket edip güç strokunu gerçekleştirmektedir. Bunun sonucunda dinein 5. Termodinamik hale geçmiş bulunmaktadır (TH5: ADP, α, post). Literatürdeki dinein motor bölgesi yapıları incelendiğinde, sadece TH3 ve TH5 halindeki yapıların bulunduğu görülmüştür. Bu tez çalışmasında, ilk adım olarak kuvvet kolunun TH3yapısından başlayarak TH2'deki yapısına ulaşma amaçlı olarak bir dizi moleküler dinamik (MD) simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Bu amaca yönelik olarak TH5'teki kuvvet kolu yapısı hedef olarak konulmuş ve bu hedefe doğru kuvvet kolu hareketi yönlendirilmiş MD simülasyonları ve kısıtlanmış MD simülasyonlarının bir kombinasyonu olan protokol ile modellenmiştir. Bu modelleme sonucunda ortaya çıkan kuvvet kolu hareketi, sonrasında gerçekleştirilen şemsiye örneklendirilmesi ile detaylandırılmış ve kuvvet kolu hareketi ile ilgili geniş yapısal örnekleme elde edilmiştir. Çalışmanın başında SMD parametrelerini belirleyebilmek adına literatür çalışması yapılmış ve hız 1 Å/ns olarak belirlenmiştir. Daha sonrasında SMD atomlarını ve sabitlenecek atomları belirleyebilmek adına sırasıyla 3 set deneme simülasyonları yapılmış ve kuvvet kolunun modellenmesi için uygun olan parametreler elde edilmiştir. Kuvvet kolunun modellenmesi için yapılan birbirini takip eden 11 MD simülasyonu döngüsü gerçekleştirilmiştir. Her bir MD simülasyonun döngüsünde bir adet SMD simülasyonu ve onu takip eden bir adet kısıtlanmış MD simülasyonu gerçekleştirilmiştir. SMD simülasyonlarında kuvvet kolu üzerinde kuvvet uygulama suretiyle sabit hızda hedefe doğru ilerletilmektedir. Kısıtlanmış MD simülasyonlarında ise kuvvet kolu dış kuvvetlerle SMD sonucunda geldiği pozisyonda sabitlenmektedir. 8. MD döngüsünde kuvvet kolu, dineinin baş yapısı ile yapısal çakışma yaşamıştır. Bu yapısal çakışmanın daha önceden olabileceği literatürde belirtilmiş ancak atomik düzeyde kanıtlanmamıştır. Kuvvet kolunun bükük yapısından başlayarak çakışmanın gerçekleştiği düz yapısına kadar olan geçişin daha detaylı örneklemek için şemsiye örneklemeleri yapılmıştır. Şemsiye örneklendirilmesinde bir reaksiyon koordinatı belirlenip, sistemin o reaksiyon koordinatının belli bir değerini örneklemesi için dış potansiyel uygulanmaktadır. Şemsiye örneklemesi için belirlenen reaksiyon koordinatı kuvvet kolunun düz yapısına olan ortalama karesel sapması belirlenmiştir. Şemsiye örneklemesi için gerekli olan yapılar MD simülasyon döngülerinin sonlarındaki yapılar seçilmiş ve örneklenmeye başlanmıştır. Daha sonrasında elde edilen yapıların dağılımları incelenerek ana bileşenler analizi tüm reaksiyon koordinatı üzerinde gerçekleştirilerek şemsiye örneklemesi MD simülasyonları süresince dinein kuvvet kolunun yaptığı başlıca hareketler belirlenmiştir. Daha sonrasında ağırlıklı histogram analizi yöntemi kullanılarak dineinin kuvvet kolunu hareketi sırasında oluşan serbest enerji yüzeyi reaksiyon koordinatının bir fonksiyonu olarak oluşturulmuştur. Elde edilen serbest enerji profiline göre kuvvet kolunun ATP bağlandıktan sonra TH2'den TH3'e geçişi enerjetik açıdan elverişli bir proses olduğu görülmüş olup bunun sonucunda serbest enerji değişimin ~ -40 kJ/mol olduğu görülmüştür. Daha sonrasında ise açığa çıkan enerji farkının nereden geldiğini analiz etmek için kırılan ve yeniden kurulan tuz köprüleri MD simülasyon yörüngeleri boyunca incelenmiş ve reaksiyon koordinatına göre gruplandırılarak, kuvvet kolunun hareketi süresince nerede hangi bağların kurulduğu ve bozulduğu atomik boyutta incelenmiştir. Kuvvet kolu hareketi sırasında 9 tane tuz köprüsünün kırıldığı ve oluştuğu görülmüştür. Bunlardan 6 tanesi düz yapıda, üç tanesi ise bükük yapıda mevcuttur. Kırılan ve tekrardan kurulan tuz köprülerin serbest enerji yüzeyi ile uyumlu olduğu ve proses için önemli olduğu sonucunda varılmıştır. Tez çalışması sonucuna, dinein mekanokimyasal çevriminde literatürde henüz tam anlamıyla aydınlatılmamış bir dinein termodinamik hali olan TH2 ile ilgili son derece önemli bilgiler elde edilmiştir.

Özet (Çeviri)

Eukaryotic cells are required intracellular order to perform fundamental activities. Intracellular organization of the eukaryotic cells are provided by cytoskeletal motor proteins moving across the cytosolic tracks, which are microtubules (MT) and actin filaments, by hydrolyzing Adenosine Triphosphate (ATP). These motor proteins take crucial roles in the eukaryotic cells, such as ciliary beating, muscle contractions, cell divisions, vesicular transport, and neuronal development and transportation. Cytoskeletal motor proteins are differ in their structure, movement direction, cytosolic tracks that they bind, and the cargos that they carry. These motor proteins are divided in three families; kinesin, dynein, and myosin families. Members of kinesin and dynein families move along the MT, whereas myosin family members move along the actin filaments. Kinesin protein family comprises members moving to plus (+) or minus (-) end of the MT. Myosin family member motor proteins move eithrt to barbed (+) or pointed (-) end of the actin filaments. Dynein motor proteins, on the other hand, move towards to minus end of the MT. Cytoplasmic dynein interacts with many intracellular pathways. Dyneins carry aggregated proteins, transcription factors mRNA containing particles, viruses, membrane-bound organelles, phagosomes, vesicles moving from the endoplasmic reticulum (ER) to golgi, lipid droplets, lysosomes, melanosomes, peroxisomes, mitochondria, and endosomes. In neurons, dynein drives retrograde transport towards the cell body and is required for neuronal migration, growth, and synapse formation. Numerous neurodegenerative diseases, including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth, Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's, lissencephaly and ciliary dyskinesia. This close relationship necessitates; especially if new therapeutic strategies are considered; understanding the operation of dynein and functional malfunctions causing those diseases. Dynein also plays important roles in cell division, such as maintenance of the proper tension and length of the spindle, focusing MTs into spindle poles, and regulation of the spindle assembly checkpoint activation and proper chromosome segregation. Understanding how dynein generates motility and force on MTs is essential to develop novel chemical inhibitors/modifiers of dynein function for the treatment. Cytoplasmic dynein is composed of two identical dynein heavy chains (DHCs) and several smaller associated polypeptides. DHC contains a C-terminal motor domain (head) and an N-terminal tail domain. The head contains six AAA modules (AAA1-AAA6) organized into a hexameric ring. ATP hydrolysis occurs in AAA1-AAA4 domains, where AAA1 is the main ATP site and necessary for motility. In addition to the AAA+ domain, dynein also contains the linker, the stalk, the buttress, and the C-terminal domain. ATP binding and beginning hydrolysis results in a conformational change of the linker from a straight conformation to a bent conformation. This conformational change is referred to as the priming stroke. Upon microtubule binding, the power stroke of dynein takes place during which the linker returns to a straight conformation. To the best of our knowledge, all-atom Molecular Dynamics (MD) simulations of the linker movement during the priming and power stroke have not been performed in the literature. Moreover, the energetics and structural mechanism remains to be elucidated. For the full length dynein motor domain only a very limited number of all-atom MD simulations studies exists in the literature. Recently, MD simulations of human dynein-2 in its pre-power stroke state in the presence of explicit water and ions was performed in the literature. Using the solvated and equilibrated full length motor domain conformation of this study (~800,000 atoms in size), an extensive set of new MD simulations totalling 500ns in length were performed. In these MD simulations the linker domain is guided towards its post-power stroke structure and free energy surface along the transition is constructed. As a first step, an initial transition path of the dynein linker was constructed by using a combination of steered MD (SMD) simulations and constrained MD simulations. As a result of SMD simulations, conformations were sampled along the linker transition pathway and the steric clash due to the contact between the linker and the AAA4 were observed. Subsequently, umbrella sampling MD (UMD) simulations were performed. UMD simulations were performed to estensively sample the transition pathway and explore the energetics of the linker conformational transition. RMSD of the linker to its straight conformation was selected as the reaction coordinate ξ. Wheighted Histogram Analysis Method (WHAM) was applied using the UMD simulations data. And the free energy surface as a function of ξ was constructed. Free energy difference between of the bent and the straight conformations of the dynein linker was obtained ~ -40 kJ/mol. Thus, indicating that linker movement during the priming stroke is energetically favorable. All UMD simulations were combined into a single trajectory and principal component analysis were performed to investigate main features of the linker transition. Distribution of inter and intra domain salt bridge of the linker were investigated along the transition pathway. 9 salt bridges forming or breaking during the linker transition were identified. Among them 6 salt bridges were present in the straight conformation while 3 were present in the bent conformation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    909008

    Modeling dynein dynamics and its interactions with microtubules and microtubule-associated proteins using molecular dynamics simulations

    Moleküler dinamik simülasyonları kullanarak dinein dinamiğinin ve mikrotübüller ve mikrotübül ilişkili proteinlerle etkileşimlerinin modellenmesi

    MERT GÖLCÜK

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyofizikİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MERT GÜR

  2. Tez No

    541840

    Katkısız ve ZnO nanoparçacık katkılı NIPAM nanojellerininsentezlenmesi ve karakterizasyonu

    Synthesis and characterization of undoped and ZnO nanoparticles doped NIPAM nanogels

    OĞUZ GÜRCÜOĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Fizik ve Fizik Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Fizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ESRA ALVEROĞLU DURUCU

  3. Tez No

    544034

    Damar içinde kan akışının modellenmesi

    Modeling of intra-vessel blood flow

    BETÜL UYSAL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Makine Mühendisliğiİstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EROL UZAL

  4. Tez No

    559423

    İnsan hareketi izleme teknolojilerinin karşılaştırmalı değerlendirmesi

    Comparative assessment of human motion monitoring technologies

    CEMAL FATİH KUYUCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrolİstanbul Teknik Üniversitesi

    Bilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ GÖKHAN İNCE

  5. Tez No

    866216

    Design of additively manufactured hybrid structural brackets via topology optimization

    Topoloji optimizasyonu ile eklemeli imalata uygun hibrit yapısal braketlerin tasarımı

    CENGİZ KÖSEOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Makine Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MESUT KIRCA

Geri Dön