Directed evolution of a cytochrome p450 enzyme to increase peroxidation activity
Peroksidasyon aktivitesini artırmak için sitokrom p450 enziminin yönlendirilmiş evrimi
- Tez No: 613603
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ NUR BAŞAK SÜRMELİ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biyomühendislik, Biochemistry, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 71
Özet
Yönlendirilmiş evrim, doğal seçilimden esinlenilmiş ve yeni enzimler tasarlamak için kullanılan etkili bir yöntemdir. Doğada bulunan enzimlere, istenilen özellikleri eklemek ya da geliştirmek için, ötelemeli rastgele mutasyon ve devamında tarama/seçme metodu uygulanır. Enzim aktiviteleri, enzimin aktif kısmında bulunan amino asitlerin değiştirilmesi ile yükseltilebilir. Sitokrom P450 protein ailesinin üyesi olan CYP119, Sulfolobus acidocaldarius'tan izole edilmiştir ve termofilik bir enzimdir. Buna ek olarak CYP119 enzimi monooksijenaz, peroksidaz ve oksidoredüktaz aktivitesi göstermektedir. Bu özellikleri ile CYP119 enzimi saf kimyasalların ve farmasötiklerin üretiminde kullanılmak üzere potansiyel taşımaktadır. Bu çalışmada, Thr213.-Thr214 ve Val151-Phe153 pozisyonlarında değişiklik yapılmış iki farklı CYP119 mutant kütüphanesi artırılmış peroksidaz aktivitesi için taranmıştır. Buna ek olarak, hidrojen peroksiti CYP119'un kofaktörü olarak kullanan, floresan tabanlı Amplex Red testi optimize edilmiştir. Mutant kütüphanelerinin taranması, Thr213-Thr214 mutant kütüphanesinden dört adet peroksidasyon aktivitesi geliştirilmiş mutanın açığa çıkarılmasını sağlamıştır. Val151-Phe153 kütüphanesinden peroksidasyon aktivitesi geliştirilmiş mutant bulunamamıştır ve 151-153 pozisyonlarındanki amino asit değişikliklerinin aktiviteye herhangi bir etkisi olmadığı gözlemlenmiştir. Ek olarak, önceden belirlenmiş pozisyonlardaki amino asitlerin değiştirilmesinin etkileri de incelenmiştir. Moleküler doking uygulandığında, Amplex Red substratı, özellikle geliştirilmiş mutant enzimler ile tekli veya ikili hidrojen bağı yapmaktadır. Bununla birlikte, geliştirilmiş mutant enzimlerde, Amplex Red'de bulunan azot atomunun heme grubunda bulunan demir atomuna, yabanıl tipe göre, daha yakın olduğu gözlemlenmiştir. Böylece, seçilen mutant CYP119 enzimler geliştirilmiş peroksidasyon aktivitesine sahip olmuştur
Özet (Çeviri)
Directed evolution, mimicking the natural selection, is a powerful tool to create novel enzymes. Evolution of natural enzymes to achieve desired properties are performed in iterative rounds of random mutagenesis followed by a screening/selection method. Enzyme activity can be enhanced with substituting the active site amino acids in the enzyme. CYP119, a member of cytochrome P450 protein family, is a thermophilic enzyme extracted from Sulfolobus acidocaldarius that exhibits monooxygenase, peroxidase and oxidoreductase activity. These properties give CYP119 a potential to be used in production of fine chemicals and pharmaceuticals. Herein, two different mutant libraries of CYP119, containing substituted amino acids at Thr213-Thr214 and Val151-Phe153 positions, constructed via combinatorial active site saturation test (CAST), and screened for improved peroxidation activity. Additionally, fluorescence based Amplex Red peroxidation activity assay using hydrogen peroxide as cofactor of CYP119 was optimized. Screening of mutant libraries resulted four improved CYP119 mutant enzymes from Thr213-Thr214 mutant library. Val151-Phe153 mutant library did not yield any improved peroxidation activity mutants which indicated amino acid substitutions at 151-153 positions do not have any effect on peroxidation activity of CYP119. Furthermore, effect of substituted amino acids at predetermined positions were analyzed. Substrate, Amplex Red, makes single or double hydrogen bond when molecular docking was performed on improved mutant enzymes also distance of nitrogen atom in Amplex Red to heme iron is closer than wild type CYP119 in improved mutant enzymes. Thus, increasing the peroxidation activity of mutant CYP119 enzymes.
Benzer Tezler
- Characterization of designed novel cytochrome P450 for industrial biocatalysis
Endüstriyel biyokataliz için tasarlanmış yeni sitokrom P450'nin karakterizasyonu
TUĞÇE SAKALLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Biyokimyaİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NUR BAŞAK SÜRMELİ ERALTUĞ
- Generation of mutant libraries for directed evolution of a thermophilic P450 enzyme
Termofilik bir P450 enzimin yönlendirilmiş evrimi için mutant kütüphanelerinin oluşturulması
EMRE HAKLI
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ NUR BAŞAK SÜRMELİ
PROF. DR. ERDAL BEDİR
- Directed evolution of industrially important properties of Fusarium oxysporum
Evrimsel mühendislik yöntemi ile Fusarium oxysporumun endüstriyel özelliklerinin geliştirilmesi
HANDE ASIMGİL
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. Z. PETEK ÇAKAR ÖZTEMEL
DOÇ. DR. CANDAN TAMERLER BEHAR
- Directed evolution of multiple stress resistance in Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae'nin yönlendirilmiş evrim yöntemi ile birden fazla strese dirençli hale getirilmesi
URARTU ŞEKER
Yüksek Lisans
İngilizce
2003
Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ZEYNEP ÇAKAR
- Directed evolution of industrially important characteristics of ophiostoma piliferum
Ophiostoma piliferumun endüstriyel açıdan önemli özelliklerinin yönlendirilmiş evrimi
BERNA TOKTAY
Yüksek Lisans
İngilizce
2004
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR ÖZTEMEL
DOÇ. DR. CANDAN TAMERLER BEHAR