Farklı şaperon plazmitleri kullanılarak Escherichia coli' de rekombinant omp25 proteinin ekspresyonunun optimizasyonu
Optimization of rekombinant omp25 protein expression in Escherichia coli by using different chaperone plazmids
- Tez No: 635546
- Danışmanlar: DOÇ. DR. TÜLİN ARASOĞLU
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 109
Özet
E.coli, kısa sürede hızlı bir şekilde kültüre alınabilmesi ve yüksek verimli protein üretimi gibi sahip olduğu avantajlar nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan konakçı organizmadır. E.coli sitoplazma, birçok avantajı nedeniyle yüksek düzeyde protein üretimi için en çok tercih edilen hücresel bölmedir. Ancak bu kompartmanda protein üretimi sıklıkla inklüzyon cisimcikleri oluşumu ile sonuçlanır. E.coli' de inklüzyon cisimcikleri olarak üretilen rekombinant proteinler; inaktif, agregat oluşturan, çözünmeyen, genellikle doğal olmayan moleküler disülfit bağlara ve olağandışı serbest sisteinlere sahip yapılardır. Aktif proteinin inklüzyon cisimlerinden in vitro olarak geri kazanımı büyük ölçekli üretim için çok pahalı olabildiğinden bu proteinlerin doğal üç boyutlu yapı oluşumunu sağlamaya yönelik stratejiler günümüzde önemi korumaktadır. Sunulan çalışmada sitoplazmada inklüzyon cisimciği oluşturduğu bilinen ve bruselloza hastalığına karşı majör antijenlerden olan rekombinant Omp25 proteininin; farklı moleküler şaperonlar kullanılarak sıcaklık ve indükleyici konsantrasyonu açısından ekpresyonun indüklenmesi stratejileri ile protein çözünürlüğü ve doğru katlanmanın arttırılması hedeflenmektedir. Çalışmada DnaK/DnaJ/GrpE/GroES/GroEL ve trigger faktör sitoplazmik şaperonlarını farklı kombinasyonlarda içeren pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16 şaperon plazmitleri kullanılmış, iki ayrı sıcaklık ve iki ayrı IPTG konsantrasyonu çözünürlüğün artırılması için optimizasyon parametreleri olarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, 25 °C'de indüklenen ekspresyonun 30°C'de ekspresyona kıyasla supernatanttaki toplam protein miktarını artırdığı ancak Omp25 proteininin çözünürlüğüne etkisinin olmadığını göstermiştir. Aynı şekilde indükleyici konsantrasyonu yarıya düşürülerek yapılan çalışmada, rekombinant Omp25 proteininin çözünürlüğüne anlamlı bir etkisi gözlemlenmemiştir. Yapılan çalışmalar SDS-PAGE ve Western Blot analizleriyle doğrulanmıştır.
Özet (Çeviri)
E.coli is the most commonly used host organism for recombinant protein production because of the advantages such as rapid culture and high yield protein production in a short time. E.coli cytoplasm is the most preferred cellular compartment for high level protein production due to many advantages. However, protein production frequently results in the formation of inclusion bodies. Recombinant proteins, produced as the inclusion bodies in E. coli, are inactive, aggregate-forming, insoluble structures which have generally unnatural intra and molecular disulfide bonds and extraordinary free cysteines. In-vitro recovery of the active protein from inclusion bodies can be very expensive for large scale productions. Therefore, in order to provide the formation of natural 3-dimensional structure of proteins, increasing the protein solubility and correct folding is aimed by using different strategies. The main purpose of this study was to increase soluble expression by changing parameters such as the temperature and inducer concentrations of recombinant Omp25 outer membrane protein, one of the major antigens against brucellosis disease, which are also known to form inclusion bodies in the cytoplasm, with the help of chaperone plasmids (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) containing different cytoplasmic chaperones (DnaK/DnaJ/GrpE/GroES/GroEL and Trigger factor). Two separate temperatures (25 °C and 30°C) and two separate IPTG concentrations (1 mM and 0.5mM) were evaluated as optimization parameters to increase solubility. The results of this study claimed that the expression induced at 25 °C increased the total amount of protein of the supernatant compared to the expression at 30 °C while had no effect on the solubility of Omp25 protein. In the same context, any significant effect on the solubility of recombinant Omp25 protein was not observed although the inducer concentration was reduced by half. The studies were verified by SDS-PAGE and Western Blot analyzes.
Benzer Tezler
- İnsan Kemik Morfogenetik Protein 2'nin (BMP2) rekombinant olarak üretilmesi, biyokimyasal karakterizasyonu ve biyolojik aktivitelerinin araştırılması
Recombinant expression, biochemical characterization and biological activities of the Human Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2)
YASİN AYDIN
Doktora
Türkçe
2023
BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İSA GÖKÇE
- Heat shock response in Thermoplasma volcanium: Cloning and differential expression of molecular chaperonin (thermosome) genes
Thermoplasma volcanium'un ısı şoku yanıtı: Moleküler şaperonin (termozom) genlerinin klonlanması ve değişimsel anlatımı
FÜSUN DOLDUR
Yüksek Lisans
İngilizce
2008
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Bölümü
PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
- Investigation of the effects of the bag-1 – hsc70/hsp70 interaction on the bag-1 complexes in erad mechanism and ubiquitin/proteasome system
Bag-1 – hsc70/hsp70 etkileşiminin erad yolağı ve ubikitin/proteazom sistemindeki bag-1 komplekslerine olan etkisinin incelenmesi
EZGİ BAŞTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
Biyofizikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. GİZEM DİNLER DOĞANAY
- Bazı farmakolojik şaperonların mutant AVPR2 proteinlerinde gözlenen fonksiyon kayıpları üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of some pharmacological chaperones on observed function losses of mutant AVPR2 proteins
DİLARA ŞAHİN
- Nefrojenik diabetes insipidus hastalığına sebep olan mutantlar üzerinde bazı farmakolojik şaperonların etki mekanizmalarının araştırılması
Investigation of the mechanisms to effect of some pharmacological chaperones on mutants caused by nephrogenic diabetes insipidus disease
ELİF MERVE AVCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyolojiHacettepe ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EMEL SAĞLAR ÖZER