Geri Dön

Heat shock response in Thermoplasma volcanium: Cloning and differential expression of molecular chaperonin (thermosome) genes

Thermoplasma volcanium'un ısı şoku yanıtı: Moleküler şaperonin (termozom) genlerinin klonlanması ve değişimsel anlatımı

PDF İndir

  1. Tez No: 238266
  2. Yazar: FÜSUN DOLDUR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2008
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bölümü
  12. Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 266

Özet

Moleküler şaperonlar hücrede proteinlerin katlanması, taşınması ve agregasyonlarının önlenmesi gibi protein yapısını doğrudan etkileyen temel görevleri üstlenmiştir. Şaperoninler (Hsp60 şaperonları) oligomerik, yüksek moleküler ağırlıklı şaperonlar olup diğer şaperon sistemleri tarafından katlanamayan proteinleri katlama özelliğine sahiptirler. Isı şoku sırasında yüksek düzeyde sentezlendikleri için arkea moleküler şaperoninleri termozom olarak da anılır. Bu çalışmada ilk kez, termoasidofilik bir arkeon olan Thermoplasma volcanium' un Hsp60 altbirim genlerini (? ve ? ) klonladık ve nükleik asit dizilerini belirledik. Klonlama için PCR temelli bir yöntem izledik. T. volcanium' un kromozomal DNA' sından Hsp60 ? geninin çoğaltılması ile 1939 bç büyüklüğünde, Hsp60 ? geni için ise 1921 bç büyüklüğünde PZR ürünü elde edilmiştir. PZR amplikonlarının pDrive vektörüne bağlanmasının ardından rekombinant plazmidler E-coli TG-1 kompetan hücelerine aktarılmıştır ve rekombinant klonlar mavi/beyaz tarama yolu ile seçilmişlerdir. İki altbirim geninin klonlanması restriksiyon enzim haritalaması ve dizi analizi ile doğrulanmıştır. Daha sonra her iki altbirim geni, ardarda bir ko-ekspresyon vektörü oluşturmak üzere pUC18 vektörüne klonlanmıştır. Her iki altbirim geninin, kendi promotörlerinin kontrolü altında anlatımları gerçekleşmiş ve bunun sonucunda etkin Hsp60 şaperon (termozom) gerçeklemiştir. Rekombinant termozomun şaperon aktivitesi domuz sitrat sentaz enzimi substrat olarak kullanılarak gösterilmiştir. 50°C' de 2,5 saat inkübasyon sonunda termozomun yeniden katlanma sağladığı gözlenmiştir. Bu koşullar altında sitrat sentazın etkinliği kontrol ve test için sırasıyla ? mA412/min:19.0 and ? mA412/min:24.0 olarak bulunmuştur. Clustal W Versiyon 1.82 programı kullanılarak T. volcanium' un Hsp60 ? ve Hsp60 ? proteinleri ile farklı ökaryot, bakteri ve arkea Hsp60 proteinlerinin çoklu dizi hizalaması yapılmıştır. En fazla dizi benzerliği T. volcanium ve T. acidophilum'un ? (%94) ve ? proteinleri (%93) arasında saptanmıştır. Veritabanlarında ortolog grupların ve korunmuş bölgelerin karşılaştırması, T. volcanium' un Hsp60 ? ve Hsp60 ? genlerinin çeşitli ökaryot, bakteri ve arkea Hsp60 proteinleriyle filogenetik ilişkisini ortaya koymuştur. Her iki altbirim geninin ısı şoku (65°C, 70°C ve 75°C sıcaklıklarda) ve oksidatif stres (0,008 mM, 0,01 mM, 0,02 mM, 0,03 mM ve 0,05 mM H2O2 ile oluşturulan) ile uyarılmaları gerçek zamanlı PZR ve çoğaltılmış cDNA bant yoğunluk analizi ile incelenmiştir.

Özet (Çeviri)

Chaperonins (Hsp60 chaperones) comprise a class of oligomeric, high-molecular-weight chaperones that have the unique ability to fold some proteins that cannot be folded by simpler chaperone systems. The term ?thermosome? is used for molecular chaperonins from Archaeal organisms since they accumulate to high levels upon heat-shock. In this study first time, we have cloned and sequenced two Hsp60 subunit genes (? and ß) from a thermoacidophilic archaeon Thermoplasma volcanium. For cloning we have followed a PCR based strategy. Amplification of Hsp60 ? gene from chromosomal DNA of T. volcanium yielded a product of 1939 bp amplicon and that of Hsp60 ß gene yielded a product of 1921 bp amplicon. After ligation of the PCR fragments to pDrive vector, recombinant plasmids were transferred into E. coli TG-1 competent cells and recombinant colonies were selected by blue/white screening. The cloning of two subunit genes were confirmed by restriction mapping and by sequencing. Both subunit genes were then subcloned to pUC18 vector consequtively to construct a co-expression vector. Both subunit genes were expressed under control of their own promoters leading to production of active Hsp60 chaperonin (thermosome). Chaperone activity of the recombinant thermosome was shown by using pig citrate synthase enzyme as substrate. Thermosome induced refolding was observed when renaturation was carried out at 50°C for 2,5 h. Under this condition, citrate synthase activities associated with control and test were ? mA412/min:19.0 and ? mA412/min:24.0 respectively. Clustal W Version 1.82 was used for multiple sequence alignments of Hsp60 ? and Hsp60 ? proteins of T. volcanium and other Hsp60 proteins from various eukaryotes, bacteria and archaea. The highest sequence similarity was found between ? subunit proteins of T. volcanium and T. acidophilum (94%) and ß subunit proteins of T. volcanium and T. acidophilum (93%). Clusters of orthologous groups and conserved domain database searches revealed the phylogenetic relationships between Hsp60 ? and Hsp60 ? subunits of T. volcanium thermosome and other Hsp60 proteins from various eukaryotes, bacteria and archaea. Induction of both subunit genes under heat shock (65°C, 70°C and 75°C for 2h) and under oxidative stress (imposed by 0,008 mM, 0,01 mM, 0,02 mM, 0,03 mM and 0,05 mM H2O2) conditions was studied by Real-Time PCR technique and amplified cDNA band density analysis.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    383077

    Transcriptome analysis of Thermoplasma volcanium GSS11 under extreme stress

    Thermoplasma volcanium GSS11'ın ekstrem stres altında transcriptom analizi

    SEMA ZABCI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK

  2. Tez No

    286263

    The role of small heat shock proteins of the thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma volcanium in the stress response

    Thermoasidofilik bir arkea olan Thermoplasma volcanium?un küçük ısı şoku proteinlerinin stres tepkisindeki rolü

    SEMA AYGAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Bölümü

    PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK

  3. Tez No

    338544

    Expression profiling of Thermoplasma volcanium GSS1 under stress conditions with specific emphasis on proteasome associated regulatory VAT genes

    Thermoplasma volcanium GSS1'in stres koşulları altında proteazoma ilişkin düzenleyici VAT genleri ağırlıklı olmak üzere gen anlatım profilinin belirlenmesi

    TÜLAY YILMAZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK

  4. Tez No

    371730

    Structural modelling and functional analysis of the engineered small heat-shock protein,TPV-HSP14.3 from Thermoplasma volcanium

    Thermoplasma volcanıum'un modifiye edilmiş küçük ısı şoku proteini TPV-HSP14.3 yapı modellemesi ve işlevsel analizi

    ILIR SHERAJ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK

  5. Tez No

    782348

    Kabak bitkisinde ısı şoku proteini ve ısı şoku faktörü genlerinin biyoinformatik karakterizasyonu ve farklı abiyotik stres koşullarında ifade profilleri

    Bioinformatics characterization of heat shock protein and heat shock factor genes in zucchini and expression profiles in different abiotic stress conditions

    KEVSER BETÜL CEYLAN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiKastamonu Üniversitesi

    Genetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET CENGİZ BALOĞLU

Geri Dön