Geri Dön

Synthetic genetic circuits to monitor nanomaterial triggered toxicity

Nanomalzeme kaynaklı toksisitenin gözlemlenmesi için tasarlanan sentetik gen devreleri

PDF İndir

  1. Tez No: 641378
  2. Yazar: BEHİDE SALTEPE
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Bioengineering, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2020
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 248

Özet

Son bir kaç onyıl içerisinde çeşitli alanlarda nanomalzeme kullanımı artmıştır. Bunun temel sebeplerinden biri, nanomalzemelerin sahip olduğu eşsiz özelliklerdir. Bu özelliklerden başlıcaları, boyuta bağlı olarak değişen ve ayarlanabilen optik ve fiziksel özelliklere sahip olmalarıdır. Artan nanomalzeme kullanımı ile bu malzemelerin insan ve çevre üzerindeki etkilerine dair endişeler de artmaktadır. Küçük boyutları sayesinde nanomalzemeler, hücre duvarlarından kolayca geçebilmektedir. Aynı zamanda, yüksek yüzey alanı-hacim oranı sayesinde bu malzemeler katalitik olarak oldukça aktif olabilmektedirler. Bunun sonucunda da hücre içerisinde stres yaratma potansiyeline sahiptirler. Bu stres belirtilerinin başlıcaları protein katlanmalarında hatalar, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşması ve DNA hasarıdır. Bu yüzden, nanomalzemelerin insan üzerinde kullanımından önce (kontrollü ilaç salınımı ya da manyetik görüntüleme gibi) bir takım biyouyumluluk testinden geçmesi gerekmektedir. Yine de, günümüzde kullanılan biyouyumluluk testleri oldukça komplike olmakla birlikte geç sonuç vermektedir. Bu tezin amaçlarından biri, hızlı cevap verebilen yaşayan bir biyouyumluluk testi oluşturmaktır. Bu sayede, toksik olan nanomalzemelerin modifikasyonları daha erken yapılabilecek, böylelikle toksik olmayan nanomalzemelerin kullanıma girmesi daha hızlı olabilecektir. Bu doğrultuda genel bir stres göstergesi olan ısıl-şok protein mekanizması (HSR) seçilmiştir. Bu mekanizma, sentetik biyoloji yaklaşımları kullanılarak yeniden düzenlenmiş ve sentetik gen devreleri oluşturulmuştur. Öncelikle, stres durumunda en çok aktif rol alan dört farklı proteinin promotör bölgeleri seçilmiştir. Bu promotörlerin her biri ile ayrı ayrı gen devresi oluşturulmuştur. Bu gen devrelerinde, her bir promoter, bir raportör gen ifadesini kontrol etmektedir. Yapılan ilk denemeler sonucunda elde edilen bulgulara göre, ısıl-şok proteinleri hücre savunma mekanizması için rol aldığından oldukça aktif olup, stres olmadığı zamanlarda da yüksek raportör sinyali verdiği gözlemlenmiştir. Bu yüzden, tek başlarına bu promotörlerin kullanılamayacağına karar verilmiştir. Stres kaynağı olmayan durumdaki gürültü sinyalini düşürmek amacıyla, literatürde daha önce geliştirilmiş olan riboregülatör sekanslarının kullanılmasına karar verilmiştir. Böylece her bir promotör riboregülatörler ile yeniden düzenlenmiş, yeni gen devreleri oluşturulmuştur. Elde edilen bulgular, oluşturulan bu yeni sensörlerin, gürültü sinyalini hemen hemen tamamen yok ettiğini göstermiştir. Ancak, stres uygulamasından sonra beklendiği şekilde yüksek sinyal elde edilememiş, riboregülatörler toksisite sinyalini de düşürmüştür. Sensör sinyalini arttırmak amacıyla, sensör içerisinde bir pozitif geribesleme döngüsü eklenmiştir. Bunun için bakteriyel iletişim (QS) mekanizması ile ısıl-şok mekanizması birleştirilmiştir. Bu sayede ortamda var olan stres durumundan bütün bakterilerin haberdar olup birbirini uyarması amaçlanmıştır. Beklendiği üzere sensörün sinyal seviyesi oldukça artmıştır. Ancak bununla birlikte, gürültü sinyalinde de aynı oranda artış gözlemlenmiştir. Bu yüzden, Escherichia coli içerisindeki gibi aktivasyona dayalı ve yüksek gürültü veren sistem kullanmak yerine, baskılamaya dayalı yeni bir sisteme geçilmesi kararlaştırılmıştır. Bu yüzden, Mycobacterium tuberculosis ısıl-şok mekanizması örnek olarak alınmıştır. Oluşturulan gen devreleri, model nanomalzeme olarak kullanılan kuantum noktacıklara (QD) 1 saat içerisinde oldukça yüksek tepki vermiştir. Oluşturulan bu sensörler ile de nanomalzeme toksisitesi oldukça hızlı tespit edilebilecek, karmaşık deneylere (hayvan deneyleri gibi) gerek duyulmadan, toksik olan nanomalzemelerin yeniden gözden geçirilerek modifikasyonlar yapılmasına olanak sağlayacaktır. Bu çalışmasının ikinci kısmı da oluşturulan toksisite sensörlerini kaynak gösterecek şekilde tasarlamak, bu sayede ortamda toksisite yaratan malzemenin ne olduğuna dair rapor elde etmektir. Bunun için de ısıl-şok yolağı ile ağır metal spesifik transkripsiyon faktörleri (altın için GolS, kadmiyum için ise MerR(mut) ve CadR) birleştirilmiştir. Bunun için altın ve kadmiyum iyonları model olarak seçilmiştir. Bu sistemler rekombinaz ile birleştirilerek yeni gen devreleri tasarlanmıştır. Bu gen devrelerinde, rekombinaz, stres ile aktive olarak ters halde duran metal spesifik promotörü düzleştirmekte, bu sayede de ilgili metal varlığında raportör gen ifadesi başlamaktadır. Bu sayede stres faktörünün kaynağının altın ya da kadmiyum olarak belirlenmesi mümkündür. Son olarak, memeli hücresi kullanılarak toksisite sensörü yapılması amaçlanmıştır. Öncelikle, bakteriler ile yapılan yaklaşımlara benzer şekilde, stres durumunda aktif rol oynayan iki farklı ısıl-şok protein ailesi seçilmiştir. Bunlardan birincisi, hücrelerin genel savunma mekanizması olan HSP70 ailesi iken, diğeri de küçük ısıl-şok protein ailesine ait α-Bcrystallin proteinidir. Her iki proteinin promotör bölgesi raportör gen ifadesini kontrol edecek şekilde tasarlanmıştır. Oluşturulan her iki devre de ısı ve kadmiyum iyonları ile test edilmiştir. HSP70 ailesi hücre içerisinde oldukça aktif olduğundan, stres uygulanmayan durumlarda da yüksek sinyale sebep olmuştur. α-Bcrystallin ile oluşturulan sensörde ise, ısıl-şokun ardından bir miktar artış gözlense de, sensör çalışmaları için yeterli değiltir. Bu sebeple, bakteriyel sensörlerde yapıldığı gibi baskılayıcı gen devresi tasarımına karar verilmiştir. Öncelikle, ısıl-şok promotörlerini baskılayıcı genin (HspR) memeli hücrelerde de ifade edilebildiği gösterilmiştir. Daha sonrasında minimal promotör bölgesine (SV40) HspR bağlanma dizileri tekli ve çiftli tekrarlar halinde eklenerek raportör gen ifadesindeki azalış ve artışlar takip edilmiştir. Oluşturulan devreler ısıl-şok ve kadmiyum iyonları ile test edilmiştir. Elde edilen sonuçlara gore, HspR varlığında raportör gen ifadesinde azalış olduğu gözlemlenmiştir. Ancak, stres uygulamasının ardından belirgin bir sinyal artışı elde edilememiştir. Bu yüzden, oluşturulan gen devrelerinin optimizasyonunun yapılması ve sensörün optimum çalışma koşullarının tespit edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışma ile bakteriyel ve memeli bütün hücre sensörü tasarlanma prensipleri ele alınmıştır. Oluşturulan bakteriyel sensörler, nanomalzemelerin toksisite tayini için güçlü bir adaydır. Şimdiye kadar yapılan çalışmaların aksine, bu çalışmada, hücreleri toksisite tayini için programlarken çeşitli mühendislik yaklaşımları kullanılmıştır (riboregülatörler, bakteriyel iletişim mekanisması, promotör üzerinde yapılan çeşitli değişiklikler v.b.). Sonuç olarak, kullanımı kolay, hızlı cevap veren ve ucuz bir toksisite testi elde edilmiştir. Ayrıca, memeli hücresi kullanılarak yapılan biyosensör çalışmasının optimizasyon gerektirmesine rağmen, tüm hücre sensörü alanı için nitelikli bir tasarım örneğidir. Literatürde memeli hücrelerinin toksisite tayini için programlanmasına nadiren rastlanmaktadır. Bu sebeple, buradaki çalışma da Alana önemli bir katkı sağlayacak türden olmuştur. Genel anlamda bu çalışma nanomalzeme toksisitesi tayinini hızlı bir şekilde sağlayarak, toksik olan nanomalzemelerin yeniden yapılandırılarak alana daha hızlı şekilde uygulanabilmesini sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

In the past decades, nanomaterial (NM) usage in various fields has been of great interest because of their unique properties that show tuneable optical and physical properties depending on their size. Yet, safety concerns of NMs on human or environment arise with increased NM usage. Thanks to their small size, NMs can easily penetrate through cellular barriers and their high surface-to-volume ratio makes them catalytically active creating stress on cells such as protein unfolding, DNA damage, ROS generation etc. Hence, biocompatibility assessment of NMs has been analyzed before their field application such as drug delivery and imaging which requiring human exposure. Yet, conventional biocompatibility tests fall short of providing a fast toxicity report. One aspect of the present thesis is to develop a living biosensor to report biocompatibility of NMs with the aim of providing fast feedback to engineer them with lower toxicity levels before applying on humans. For this purpose, heat shock response (HSR), which is the general stress indicator, was engineered utilizing synthetic biology approaches. Firstly, four highly expressed heat shock protein (HSP) promoters were selected among HSPs. In each construct, a reporter gene was placed under the control of these HSP promoters to track signal change upon stress (i.e., heat or NMs) exposure. However, initial results indicated that native HSPs are already active in cells to maintain cellular homeostasis. Moreover, they need to be engineered to create a proper stress sensor. Thus, these native HSP promoters were engineered with riboregulators and results indicated that these new designs eliminated unwanted background signals almost entirely. Yet, this approach also led to a decrease in expected sensor signal upon stress treatment. To increase the sensor signal, a positive feedback loop using bacterial communication, quorum sensing, method was constructed. HSR was integrated with QS circuit showed that signal level increased drastically. Yet, background signal also increased. Moreover, instead of using activation based HSR system as in Escherichia coli, repression based system was hypothesized to solve the problem. Thus, a repression based genetic circuit, inspired by the HSR mechanism of Mycobacterium tuberculosis, was constructed. These circuits could report the toxicity of quantum dots (QDs) in 1 hour. As a result, these NM toxicity sensors can provide quick reports, which can lower the demand for additional experiments with more complex organisms. As part of this study, a source detection circuit coupling HSR mechanism with metal induced transcription factors (TFs) has been constructed to report the source of the toxic compound. For this purpose, gold and cadmium were selected as model ions. In the engineered circuits, stress caused by metal ions activates expression of regulatory elements such as TFs of specific ions (GolS for gold and CadR and MerR(mut) for cadmium) and a site-specific recombinase. In the system, the recombinase inverts the promoter induced by TF-metal ion complex, and a reporter has been expressed based on the inducer showing the source of the stress as either gold or cadmium. Finally, a mammalian cellular toxicity sensor has been developed using similar approaches used in bacterial sensors. To begin with, two HSP families have been selected: HSP70 and α-Bcrystallin. Initial circuits were designed using promoter regions of both protein families to control the expression of a reporter, gfp. Both circuits were tested with heat and cadmium ions with varying concentrations and results showed that HSP70-based sensor had high background signal because of its active role in cellular homeostasis and protein folding in cells. Additionally, a slight increase was observed after heat treatment. Similar results were observed for α-Bcrystallin-based sensor; yet, these outcomes were not suitable for a desirable sensor requiring tight control. Thus, we decided to transfer the bacterial repression based toxicity sensor into mammalian cells. At the beginning, expression of the repressor, HspR, from M. tuberculosis was checked in HEK293T cell line and modified with nuclear localization signal (NLS) to localize the repressor in the nucleus. Further, a minimal promoter (SV40) controlling the expression of a reporter was engineered with single and double inverted repeats (IRs) for HspR binding. Then, HspR and engineered reporter circuits were co-trasfected to track signals at normal growth conditions and upon stress. Each circuit was tested with heat and cadmium treatment and results were showed repression of GFP expression by HspR at normal conditions, but no significant signal increase was observed upon stress. Hence, constructed mammalian circuits require more optimization to find optimum working conditions of sensors. To sum up, in this study, a powerful candidate to manufacture ordered gene circuits to detect nanomaterial-triggered toxicity has been demonstrated. Unlike previous studies utilizing HSR mechanism as stress biosensors, we re-purposed the HSR mechanism of both bacteria and mammalian cells with different engineering approaches (i.e., riboregulators, quorum sensing mechanism, promoter engineering). As a result, an easy-to-use, cheap and fast acting nanomaterial-triggered toxicity assessment tool has been developed. Also, initial principles of mammalian whole cell biosensor design for the same purpose have been indicated to expand the limited toxicity detection strategies utilizing mammalian cells. This study contributed for the detection of toxic NMs providing a feedback about the fate of these NMs so that one can engineer them to make biocompatible before field application.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    579499

    Prcell: sentetik biyoloji için sinyal yolağı programlamaya yönelik bir yazılım

    Prcell: A software for pathway programming for synthetic biology

    MECİT AKTAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolHacettepe Üniversitesi

    Biyoenformatik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ERDEM KARABULUT

  2. Tez No

    476639

    Synthetic cellular systems for whole cell biocatalysis

    Tüm hücre biyokatalizi için sentetik hücre sistemleri

    ONUR APAYDIN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Mikrobiyolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER

  3. Tez No

    538992

    Sentetik biyoloji yaklaşımıyla kontrol edilebilir hareket sistemli bir mikrobiorobot prototipinin tasarlanması ve geliştirilmesi

    Design and development of a microbiorobot prototype with controlled motion system with synthetic biology approach

    NAGEHAN KAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyomühendislikFırat Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ VENHAR ÇELİK

  4. Tez No

    372533

    Modeling and evolutionary analysis of gene regulatory networks

    Genetik düzenleyici ağların matematiksel modellenmesi ve evrimsel analizi

    SEHER UĞURCUKLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Biyomedikal Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. CEM ÖZEN

    DOÇ. DR. ALBERT GÜVENİŞ

  5. Tez No

    678870

    Yeşil floresan protein ifadeleyen escherichia coli hücre fabrikalarda fenotipik heterojenitenin adaptasyona etkisi

    Impact of phenotypic heterogenity in green flouresance protein expressing escherichia coli cell factories on adaptation

    SENİHA GÖZDE ERTÜZÜN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyoteknolojiAnkara Üniversitesi

    Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EVREN DORUK ENGİN

Geri Dön