Nog gen ifadesi susturulmuş hücrelerin oluşturulması ve ipek doku iskeleleri üzerinde osteojenik farklılaşmalarının incelenmesi
Generation of Nog knockdown cells and examination of their osteogenic differentiation on silk scaffolds
- Tez No: 651820
- Danışmanlar: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU, ÖĞR. GÖR. ANIL SERA ÇAKMAK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyomühendislik, Biology, Bioengineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 164
Özet
Bu çalışma“CRISPR/Cas9 ile Nog Gen İfadesi Susturulmuş Hücrelerin Oluşturulması ve İpek Doku İskeleleri Üzerinde Osteojenik Farklılaşmalarının İncelenmesi”başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17253) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında, öncelikle moleküler gen düzenleme mekanizmaları kullanılarak (CRISPR-Cas9, siRNA), kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal yolağının antagonisti olan Noggin protein sentezinin inhibe edilmesiyle preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri üzerinde moleküler düzenlenmenin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Ardından bu hücreler ile üç boyutlu (3B) ipek doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın arttırılması hedeflenmiştir. Bu hedeflere yönelik olarak, sunulan tez çalışması 4 basamakta gerçekleştirilmiştir. İlk basamakta, Bombyx mori ipek kozalarından ipek çözeltisi elde edilmiş ve çözücü döküm partikül uzaklaştırma yöntemi kullanılarak ipek doku iskeleleri üretilmiştir. SEM görüntüleri ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözeneklilik %93.5 olarak hesaplanmıştır. Büyük gözeneklerin ortalama çapı 448±76 μm, küçük gözeneklerin ortalama çapı ise 85±27 μm olarak bulunmuştur. İpek doku iskelesinin yaklaşık 5. dk'da %1300 değerinde denge su tutma kapasitesine ulaştığı belirlenmiştir. Tez çalışmasının ikinci basamağında, MC3T3-E1 hücreleri üzerinde UltraCruz® ve Lipofektamin®3000 transfeksiyon ajanları kullanılarak kontrol CRISPR plazmidinin transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Ancak, kullanılan transfeksiyon ajanlarının etkin transfeksiyon için yeterli olmadığı saptanmıştır. Etkin transfeksiyonun sağlanabileceği elektroporasyon veya virüs bazlı transfeksiyon metotlarının kullanılması için laboratuvar koşullarımızın yeterli olmaması nedeniyle transfeksiyon çalışmalarına siRNA ile devam edilmiştir. Üçüncü basamakta, siNog ile MC3T3-E1 hücreleri üzerinde transfeksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Öncelikle kırmızı floresan işaretli kontrol siRNA/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon koşulları belirlenmiştir. Sonrasında, iki boyutlu ortamda (2B) MC3T3-E1 hücreleri üzerinde siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) analizi sonucunda, siNog grubunda Nog gen ekspresyonunun, kontrol ve negatif kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı görülmüştür (p
Özet (Çeviri)
This study was funded by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit (BAP) graduate project entitled“Generation of Nog Knockout Cells by CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing and Examination of Their Osteogenic Differentiation on Silk Scaffolds.”(FYL-2018-17253). This thesis, aimed to investigate gene editing mechanisms (CRISPR-Cas9, siRNA) to inhibit the synthesis of Noggin protein, which is an antagonist of bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway to achieve molecular regulation in MC3T3-E1 cells. Then, it is aimed to increase the osteogenic differentiation of transfected MC3T3-E1 cells seeded on silk scaffolds. For these purposes, the thesis study was carried out in 4 steps. In the first step, a silk solution was obtained from Bombyx mori silk cocoons and the solvent casting-particulate leaching process was performed to produce silk scaffolds. SEM images showed that the scaffolds have a porous structure with internal connections and the porosity was calculated as 93.5%. The average diameter of large pores was found to be 448±76 μm, while the average diameter of small pores was 85±27 μm. It was determined that equilibrium water uptake capacity of silk scaffolds reached 1300% in 5 minutes. In the second step of the thesis, the transfection study of the control CRISPR plasmid was performed on MC3T3-E1 cells using Ultracruz® and Lipofectamin®3000 transfection agents. However, it was found that the transfection agents were not sufficient for efficient transfection. Our laboratory conditions were not able to use electroporation or virus-based transfection methods to ensure efficient transfection, therefore transfection studies were continued with siRNA. In the third step, transfection studies were carried out with siNog on MC3T3-E1 cells. Primarily, transfection parameters were optimized with red fluorescence-labeled control siRNA/Lipofectamine®3000. Subsequently, a transfection study with siNog/ Lipofectamin®3000 was performed on MC3T3-E1 cells in static culture conditions. Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) analysis showed that the Nog gene expression was significantly decreased in the siNog group compared to control and negative control groups (p
Benzer Tezler
- Koroner kalp hastalıklarında adducin ve Na+ - K+ATPaz gen polimorfizmi
Adducin and Na+ - K+ ATPase gene polymorphism in coronary heart disease
NİLÜFER BOZKURT
Doktora
Türkçe
2006
Moleküler Tıpİstanbul ÜniversitesiMoleküler Tıp Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TURGAY İSBİR
- 5-fluorourasil tedavisi alan hastalarda dihidropirimidin dehidrogenaz eksikliği; klinik ve genetik olarak prevalans saptama çalışması
Dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme deficiency in patients receiving 5-fluorouracil treatment; clinical and genetic assessment of prevalence
İSMAİL ÇELİK
- Aile işletmelerinde nepotizmin işgören performansı üzerindeki etkisi: Trakya bölgesinde bir araştırma
The effect of nepothism on working performance in family businesses: A research in the Trakya region
SENEM İŞLEK
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
İşletmeBeykent Üniversitesiİşletme Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ CANDİDE ULUDAĞ
- 900 MHZ elektromanyetik alanın erişkin erkek sıçanların testis morfolojisi üzerine etkisi
The effect of 900 MHZ electromagnetic field on testis morphology of mature male rat
CANSU ÖZYILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2014
Histoloji ve EmbriyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiHistoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ERSAN ODACI
- Okul öncesi 60-72 aylık çocukların temel motor beceri gelişiminde eğitsel oyunların etkisi
The effect of educational games on the development of basic motor skills of 60-72 months pre-school children
SİNAN AKIN
Doktora
Türkçe
2015
SporDumlupınar ÜniversitesiBeden Eğitimi ve Spor Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MEHMET ACET