Understanding the pleckstrin homology (PH) domain peculiar mechanism in akt translocation, phosphorylation, and activation
Akt translokasyonu, fosforilasyonu ve aktivasyonunda pleckstrin homoloji (PH) etki alanının kendine ait mekanizmasını anlamak
- Tez No: 714868
- Danışmanlar: PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA, PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Mühendislik Bilimleri Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Mühendislik Bilimleri Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 161
Özet
Protein kinaz B (PKB, aynı zamanda Akt olarak da adlandırılır), hücre proliferasyonu, hayatta kalma, metabolizma, anjiyogenez ve apoptozda tartışmasız çok önemli bir oyuncudur. Akt, Ras-PI3K-Akt-mTOR sinyal yolunda önemli bir rol oynar. Plazma zarına Akt alımı, sinyal membran lipidi, PIP3 veya PIP2 ile etkileşime giren Pleckstrin homoloji (PH) alanı tarafından sağlanır. PH alanı ve PIP3 arasındaki etkileşim, sırasıyla PDK1 ve mTORC2 kompleksi tarafından kinaz alanındaki Thr308'in ve C-terminal düzenleyici alanındaki Ser473'ün fosforilasyonunu kolaylaştıran konformasyonel değişikliklerle sonuçlanır. Muazzam Akt aktivasyon mekanizmaları, çeşitli çalışmalar tarafından önerilmiştir; bunların tümü, Akt'nin plazma zarına yer değiştirmesinde PH alanına özgü bir rol ile sonuçlanmış gibi görünmektedir ve önceki NMR çalışmaları tarafından belirlendiği gibi, meme kanserinde PH alanı ile Calmodulin'in (CaM) moleküller arası etkileşime girdiğini ima etmektedir. Bununla birlikte, CaM'nin atomik düzeyde PH alanı ile nasıl etkileşime girdiğinin kesin mekanizması belirsizliğini koruyor. Ayrıca, Akt oto-inhibisyon durumunda veya bir“PH-in”konformerinde, PH alanı, kinaz alanındaki bir fonksiyonel kalıntının fosforilasyonunu önlemek için kinaz alanı ile intramoleküler olarak etkileşime girer. PH-kinaz allosterik arayüzündeki birkaç amino asit, PH-kinaz bölgesi oto-inhibisyonunu korur ve PH-kinaz bölgesi arayüzündeki kritik amino asitlerin mutasyonları, arayüzü bozma eğilimine sahiptir ve bu da bir“PH-out”konformer durumu ile sonuçlanır. PH alanının, Akt aktivasyonu için kritik bir olay olan membran lipidleri ile etkileşime girmesi için Akt'nin bir“PH-out”konformeri gereklidir. Ayrıca, PH-kinaz bağlayıcısında Arg 144 ile elektrostatik etkileşim oluşturan C-terminal kuyruğunda Ser 473'ün fosforilasyonu, Akt'yi aktive eden PH alanında konformasyonel yeniden düzenlemelere yol açar. Bununla birlikte, tam uzunluktaki Akt oto-inhibisyon durumunun yapısı, PH ve kinaz domain oto-inhibisyonunu anlamak için henüz kristalleştirilmemiştir. Burada, bu tezin amacı iki yönlüdür: Akt'yi plazma zarına almak için CaM'nin PH alanı ile nasıl etkileşime girdiğini ve PH alanının atomdaki kinaz alanı ile intramoleküler olarak nasıl etkileşime girdiğini PH-kinaz alanı oto-inhibisyonunda çok önemli bir rol oynayan arayüzey kalıntılarına vurgu yaparak anlamak için modelleme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonlarını kullanmak. Tezin ilk bölümünde, CaM-PH alan kompleksleri modellenmiş ve tüm atomların MD simülasyonlarına tabi tutulmuştur. Simülasyon sonuçları, CaM-PH alan etkileşimlerinin termodinamik olarak kararlı olduğunu ve bir 𝛂-sarmal etkileşimi yerine bir 𝝱-sarmalını içerdiğini, her ikisinin de NMR verileriyle uyumlu olduğunu ve elektrostatik ve hidrofobik etkileşimlerin CaM-PH kompleksini sürdürmek için kritik olduğunu göstermektedir. PH alanı, CaM lobları ile etkileşime girer; bununla birlikte, çoklu modlar mümkündür ve IP4'ün dahil edilmesi, PIP3'ün kutup başı etkileşimini, plazma membranında salıverme mekanizmasını işaret ederek CaM-PH alan etkileşimini azaltır. Tezin ikinci bölümünde, PH ve kinaz alanları arasındaki molekül içi etkileşimi araştırmak ve PH-kinaz bozulmamış arayüzünü koruyan önemli arayüzey tortularını belirlemek için aktif olmayan durumda tam vi uzunluktaki Akt'yi (480 tortu) modelledik. Ayrıca, Asp 323, önemli bir arayüz tortusu, PH-kinaz allosterik arayüzü üzerindeki etkisini ayırt etmek için His'e mutasyona uğradı. Sonuçlar, mutasyonun, ATP'nin Akt'deki ATP bağlama cebinden önemli ölçüde yer değiştirmesine yol açtığını ve kinaz alanının daha açık bir konformasyon benimsemesine yol açtığını göstermektedir. Ek olarak, RMSD ve RMSF profilleri, D323H'nin konformasyonel değişikliklerde bir artışa yol açtığını gösterir ve mutasyonun ATP bağlanma bölgesinden yaklaşık 21Â uzaklıkta olmasına rağmen, Akt'taki bu iki fonksiyonel bölge arasında belki de bir allosterik iletişim olduğu sonucuna varabiliriz. Tam uzunlukta oto-inhibe edilmiş Akt durumunun modellenmiş yapıları, farmasötik kimyagerlere, bozulmamış bir PH-kinaz arayüzü gerektiren Akt allosterik inhibitörleri ve bu tür bozulmamış PH-kinaz arayüzü gerektirmeyen ancak hücresel aktiviteleri için bozulmamış kinaz alanı N- ve C-lobları arayüzü gerektirebilecek ATP-rekabetçi inhibitörleri geliştirmeleri için rehberlik edecek en iyi temsillerdir. Allosterik ve ATP-rekabetçi inhibitörlerin geliştirilmesi, tümör hücrelerinde sıklıkla aktive edildiğinden ve düzenlenmesini gerektirdiğinden Akt'yi hedeflemek için çok önemlidir. Tez sonuçlarının, CaM-PH alan kompleksini ve sırasıyla Akt'ta PH-kinaz alanı arayüzüne ve ATP bağlama cebine bağlanan allosterik ve ATP-rekabetçi inhibitörleri hedefleyecek inhibitörlerin geliştirilmesinde işlevsel etkileri vardır. Son olarak, bu sonuçlar, tümü PH-kinaz alanı oto-inhibisyonunun gevşemesinden kaynaklanmış gibi görünen Akt kinaz aktivasyon mekanizması hakkında halihazırda var olan bilgi zenginliğine katkıda bulunur.
Özet (Çeviri)
The protein kinase B (PKB, also designated Akt), is unarguably a crucial player in cell proliferation, survival, metabolism, angiogenesis, and apoptosis. Akt plays a pivotal role in the Ras-PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Akt recruitment to the plasma membrane is enabled by its Pleckstrin homology (PH) domain, which interacts with signaling membrane lipid, PIP3, or PIP2. The interplay between the PH domain and PIP3 results in conformational changes that facilitate phosphorylations of Thr308 in the kinase domain, and Ser473 in the C-terminal regulatory domain by PDK1 and mTORC2 complex, respectively. Enormous Akt activation mechanisms have been proposed by various studies, which all seem to result in PH domain peculiar role in translocating Akt to the plasma membrane, and to implication of Calmodulin (CaM) intermolecularly interacting with the PH domain in breast cancer as established by previous NMR studies. However, the exact mechanism of how CaM interacts with the PH domain at the atomic level remains unclear. Also, in Akt autoinhibition state or a“PH-in”conformer, the PH domain intramolecularly interact with the kinase domain to prevent phosphorylation of a functional residue in the kinase domain. Several residues in the PH-kinase allosteric interface maintain the PH-kinase domain autoinhibition, and mutations of critical residues in the PH-kinase domain interface have the proclivity to disrupt the interface, resulting in a“PH-out”conformer state. A“PH-out”conformer of Akt is required for the PH domain to interact with membrane lipids, an event critical for Akt activation. Furthermore, phosphorylation of Ser473 in the C-terminal tail that forms electrostatic interaction with Arg 144 in the PH-kinase linker leads to conformational rearrangements in the PH domain activating Akt. However, the structure of full-length Akt autoinhibited state is yet to be crystalized to understand the PH and kinase domain autoinhibition. Here, this dissertation purpose is two-fold: using modeling and molecular dynamics (MD) simulations to figure out how CaM interacts with the PH domain to recruit Akt to the plasma membrane and how the PH domain intramolecularly interact with the kinase domain at the atomic level with emphasis on the interfacial residues that play a crucial role in the PH-kinase domain autoinhibition. In the dissertation's first part, CaM-PH domain complexes were modeled and subjected to all atoms MD simulations. The simulation results show that CaM-PH domain interactions are thermodynamically stable and involve a 𝝱-strand, rather than an 𝛂-helix interaction, both agreeing with the NMR data and that electrostatic and hydrophobic interactions are critical to maintaining CaM-PH complex. The PH domain interacts with CaM lobes; however, multiple modes are possible, and the involvement of IP4, polar head of PIP3 attenuates CaM-PH domain interaction, implicating the release mechanism at the plasma membrane. In the second part of the dissertation, iv we modeled full-length Akt (480 residues) in the inactive state to explore the intramolecular interaction between the PH and kinase domains and identify crucial interfacial residues that maintain the PH-kinase intact interface. Further, Asp 323, an important interface residue was mutated to His to discern its effect on PH-kinase allosteric interface. The results show that the mutation led to substantial displacement of ATP from the ATP binding pocket in Akt and led to kinase domain adopting a more open conformation. Additionally, the RMSD and RMSF profiles depict that D323H leads to an increase in conformational changes, and we deduce that although the mutation is approximately 21Å away from ATP binding site, perhaps there is an allosteric communication between these two functional sites in Akt. The modeled structures of full-length autoinhibited Akt state are best representations that would guide pharmaceutical chemists to develop Akt allosteric inhibitors, which require an intact PH-kinase interface, and ATP-competitive inhibitors that do not require such intact PH-kinase interface but might rely on intact kinase domain N- and C- lobes interface for their cellular activity. The development of allosteric and ATP-competitive inhibitors is crucial for targeting Akt since it is frequently activated in tumor cells, necessitating its regulation. The dissertation results have functional implications in developing inhibitors that would target CaM-PH domain complex and allosteric and ATP-competitive inhibitors that bind to the PH-kinase domain interface and ATP binding pocket in Akt, respectively. Finally, these results add to the already existing incredible wealth of information on the Akt kinase activation mechanism, which all seem to result from loosening the PH-kinase domain autoinhibition.
Benzer Tezler
- Understanding the emergence and transformations of the Gulf Regional Security Complex (1971-2003)
Körfez Bölgesel Güvenlik Kompleksinin ortaya çıkışını ve dönüşümlerini anlamak (1971-2003)
AHMET ÜÇAĞAÇ
Doktora
İngilizce
2022
Uluslararası İlişkilerSakarya ÜniversitesiUluslararası İlişkiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MURAT YEŞİLTAŞ
- Applications of high-order realized moments in financial market linkages
Başlık çevirisi yok
SEYİT GÖKMEN
- Understanding the choice for sustainable modes of transport in commuting trips
Başlık çevirisi yok
TUĞÇE YANAR
- Çok yönlü dış politikayı anlamak: Kırım'ın ilhakından sonra Kazakistan-Rusya ilişkileri
Understanding the multi-vector foreign policy: Kazakh-Russian relations after annexation of Crimea
ARTUR UTEBAYEV
Doktora
Türkçe
2022
Uluslararası İlişkilerİstanbul ÜniversitesiSiyaset Bilimi ve Uluslararası İlişkiler Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SAADET GÜLDEN AYMAN