Geobacillus kaustophilus'a (HTA426) ait hücre içi kollajenazın (GK2549) klonlanması ve heterelog ifadesi
Cloning and heterelogical expression of intracellular collagenase (GK2549) from Geobacillus kaustophilus (HTA426)
- Tez No: 726550
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Bakteriyel sekresyon, Kollajenaz, Peptid hidrolazlar, Bacterial secretion, Collagenase, Peptide hydrolases
- Yıl: 2022
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ondokuz Mayıs Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Kollajenazlar (3.4.24.3) hayvan bağ dokusunun temel bileşeni olan kollajeni peptid bağlarını kopararak parçalayan bir metalloproteazdır. Bu enzimler, gıda teknolojisi, sağlık sektörü, deri sanayisi, hücre kültürlerinin hazırlanması, kozmetik endüstrisi, farmasötik bileşiklerin üretimi ve fresklerin biyorestorasyonu gibi birçok alanlarda kullanılmaktadır. Tez çalışmasında Geobacillus kaustophilus'a (HTA426) ait kollajenaz (GK2549) geninin Escherichia coli'ye klonlanması, heterelog ifadesi ve sekresyonu üzerine çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu amaç için öncelikle kollejenaz geni bir ekspresyon vektörü olan pET14b plazmidine klonlanmıştır. Hücre dışına sekresyon çalışmaları için daha sonra proteinin N-terminaline OmpA (Outer membrane protein A) proteinine ait sinyal sekansı eklenmiştir. Yapılan restriksiyon haritalama ve dizi analizleri sayesinde doğrulaması yapılan rekombinant vektörler (pET14b/GeoKoll ve pET14b/ssGeoKoll) E. coli BL21(DE3) suşuna transformasyonları gerçekleştirilmiştir fakat sadece pET14b/GeoKoll rekombinant plazmidi başarılı sonuç vermiştir. Sonuç olarak; G. kaustophilus (HTA426)'a ait kollajenaz (GK2549) geni yapılan dizi analizleri sonucunda katalitik aktivitesi henüz açıklanamamış proteazların bulunduğu U32 ailesi içerisinde sınıflandırıldığı ve yüksek bir substrat seçiciliğine sahip olduğu anlaşılmıştır (Duarte et al., 2016). E. coli BL21(DE3) suşundan saflaştırılan GeoKoll enzimi ile yapılan aktivite deneyleri sonucunda enzimin sentetik bir kollejenaz substratı olan FALGPA'yı ticari muadiline göre çok yavaş bir şekilde parçalayabildiği anlaşılmıştır. Enzim aktivitesi zimogram analizleri ile belirlenmeye çalışılmıştır. Piyasadan alınan farklı kollajen çeşitleriyle yapılan zimogram analizleri sonuçlarına göre GeoKoll enzimi, balık kollajenine (Koll.1) karşı aktivite göstermemiştir. Enzim, sığır kollajeni (Koll.2) ile yapılan zimogram analizlerinde ise 55 °C'de zayıf bir aktivite göstermiştir.
Özet (Çeviri)
Collagenase (3.4.24.3) is a metalloprotease that breaks down collagen, the main component of animal connective tissue, by breaking peptide bonds. These enzymes are used in many fields such as food technology, health sector, leather industry, preparation of cell cultures, cosmetics industry, production of pharmaceutical compounds and biorestoration of frescoes. In the thesis study, studies were carried out on the cloning, heterologous expression and secretion of the collagenase (GK2549) gene of Geobacillus kaustophilus (HTA426) into Escherichia coli. For this purpose, firstly, the collagenase gene was cloned into an expression vector plasmid pET14b. For extracellular secretion studies, the signal sequence of the OmpA (Outer membrane protein A) protein was then added to the N-terminus of the protein. Recombinant vectors (pET14b/GeoKoll and pET14b/ssGeoKoll) were confirmed by restriction mapping and sequence analyzes. Then they were transformed to E. coli BL21(DE3) strain, but only pET14b/GeoKoll recombinant plasmid yielded successful results. As a result of the sequence analysis of the collagenase (GK2549) gene belonging to G. kaustophilus (HTA426), it has been understood that it is classified in the U32 family, which includes proteases whose catalytic activity has not yet been explained, and has a high substrate selectivity (Duarte et al., 2016). As a result of activity experiments with the GeoKoll enzyme purified from E. coli BL21(DE3) strain, it was understood that the enzyme can degrade FALGPA, a synthetic collagenase substrate, very slowly compared to its commercial counterpart. Enzyme activity was tried to be determined by zymogram analysis. According to the results of zymogram analyzes made with different types of collagen purchased from the market, GeoKoll enzyme did not show activity against fish collagen (Koll.1). The enzyme showed a weak activity at 55 °C in zymogram analyzes with bovine collagen (Koll.2).
Benzer Tezler
- Cloning, expression and purification of the recombinant DNA polymerase I from the hyperthermophilic bacteria Geobacillus anatolicus
Hipertermofilik Geobacillus anatolicus bakterilerinde rekombinant DNA polimeraz I'in klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
MELİKE ÇAĞLAYAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2005
Tıbbi BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. NEŞE BİLGİN
- Meyve suyu üretiminde kullanım amaçlı, pektin liyaz üreten yeni mikroorganizmaların aranması ve bulunan türlerde enzimin saflaştırılıp karakterize edilmesi
In order to use in fruit juice industry, investigation of new microorganizms producing pectin lyase enzyme and purification and characterization of these enzymes
SAFİNUR YILDIRIM ÇELİK
- Cloning, expression and purification of recombinant elongation factor ts from hyperthermophilic bacteria geobacillus anatolicus
Hipertermofilik geobacillus anatolicus bakterilerinden rekombinant elongasyon faktörü Ts'nin klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
TOROS ŞAHİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
BiyomühendislikBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEŞE BİLGİN
- Cloning, expression and purification of recombinant elongation factor tu from hyperthermophilic bacteria geobacillus anatolicus
Hipertermofilik geobacillus anatolicus bakterilerinden rekombinant elongasyon faktörü tu'nun klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması
BARIŞ AKALIN
Yüksek Lisans
İngilizce
2006
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEŞE BİLGİN
- Sıcak su kaynaklarından termofilik bakteri izolasyonu ve identifikasyonu
Isolation and identification of thermophilic bacteria species from hot springs
SEDA ERCAN AKKAYA
