Preparation and characterization of PCL/lignin sponges for bone tissue engineering applications
Kemik doku mühendisliği uygulamaları için PCL/lignin süngerlerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
- Tez No: 731640
- Danışmanlar: PROF. DR. FATMA NEŞE KÖK
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 89
Özet
Doku ve organlar, kaza, doğumsal anomaliler, hastalıklar ve benzeri nedenlerle zarar görebilir. İnsan vücudunun bu hasarları iyileştirme kapasitesi, özellikle büyük travmalarda, oldukça sınırlıdır. Bu sebeple, iyileşme sürecini tetiklemek, hızlandırmak ve bu sürece yardımcı olmak veya doğrudan hedeflenen dokunun yerini alabilecek bir yapı geliştirmek için doku mühendisliği teknikleri geliştirilmiştir. Doku mühendisliğinde, hedeflenen dokunun özellikleri için en uygun üç boyutlu iskele yapısı oluşturulur. Bu yapı hücrelerin hasarlı doku ve organları yeniden yapılandırması, yerini alması veya onarması için ilk yapısal bütünlüğü ve omurgayı sağlar. Özellikle kemik ve ilişkili hastalıklar, uygun şekilde tedavi edilmediği ve iyileştirilmediği takdirde kişinin sağlığı ve yaşam kalitesi üzerinde ciddi olumsuz etkilere neden olabilir. Her yıl milyonlarca kemik yaralanması meydana gelmekte ve bunlar hasta rahatı açısından olumsuz etkileri yanında ülke ekonomileri için de ciddi bir yük oluşturmaktadır. Bu nedenle, kemik doku mühendisliği bu sorunlara bir çözüm olarak düşünülmüştür. Bu tezde, kemik doku mühendisliğinde kullanıma uygun bir yapı iskelesi oluşturmak için sentetik ve doğal bir polimer karışımı kullanılmıştır. Sentetik polimer olarak polikaprolakton (PCL), doğal polimer olarak alkali lignin tercih edilmiştir. PCL fiziksel ve biyolojik özellikleri nedeniyle doku mühendisliği iskelelerinde sıklıkla tercih edilen bir alifatik poliesterdir. Biyouyumlu ve biyobozunur yapısı ve düşük erime ve camsı geçiş sıcaklığı tercih edilme sebeplerindendir. Ancak bozunurluğu, benzeri sentetik polimerlere kıyasla daha yavaş olduğundan, sert ve yük taşıyıcı dokuların iskeleleri için kullanımı daha uygundur. Aynı zamanda birçok sentetik polimerden daha ucuz olması ve yüksek miktarlarda üretilebilmesi de avantajlarındandır. Buna karşın, diğer birçok sentetik polimer gibi organizmada enflamasyonu ve oksidatif stresi tetikler ve hidrofobik özelliğinden dolayı hücre adezyonu ve çoğalması için uygun bir platform oluşturmaz. Bu dezavantajlara rağmen bu polimerin sıklıkla tercih ediliyor olmasının nedenlerinden biri, diğer polimerlerle kolayca kopolimer veya karışım oluşturabilmesidir. Böylece avantajlarının ön plana çıkarılacağı ve dezavantajlarının elimine edilebileceği yapılar oluşturulabilir. Lignin doğada en bol bulunan ikinci polimerdir ve çoğunlukla damarlı bitkilerin hücre duvarında bulunur. Yılda 70 milyon tondan fazla lignin kağıt endüstrisi yan ürünü olarak üretilmektedir ve bu miktarın yalnızca %2'si farklı sektörlerde kullanılarak ticarileştirilmektedir. Ligninin yapısı, bitkiler arasında önemli ölçüde farklılık gösterebilir. Ligninin kimyasal yapısı oldukça karmaşıktır ve bu nedenle standart bir yapıdan söz edilemez. Lignin birçok farklı fonksiyonel gruptan oluşabilir ve özellikleri bu fonksiyonel grupların kimyasal olarak modifiye edilmesiyle değiştirilebilir. Kırılgan ve karmaşık yapısına karşın biyouyumlu oluşu, termal kararlılığı ve antibakteriyel özellikleri nedeniyle ilgi konusu olmuştur. Aynı zamanda hücreleri oksidatif strese karşı koruduğu gözlemlenmiştir. Buna rağmen ligninin medikal araştırmalarda kullanımı oldukça nadirdir ve bu alanda ciddi bir açık bulunmaktadır. Bir doku mühendisliği iskelesi oluşturulurken kullanılacak polimerler kadar, bu polimerlerden maksimum verimin alınabilmesi için iskele yapımında doğru tekniğin kullanılması da önemlidir. Fonksiyonel doku ve organların oluşturulabilmesinde üç boyutlu hücre kültürlerinin kurulabilmesi için gözenekli sünger yapılı iskelelerin kullanımı yaygındır. Gözenekli yapılar, yüzey alanı genişlikleriyle yeni doku oluşumu için verimli bir alan ve hücrelerin madde alışverişi yapabileceği bir mikro çevre oluşturur. Özellikle büyük gözenekli (100-600 μm) iskelelerin konak kemik dokusuyla daha iyi bir entegrasyona, damarlanmaya ve kemik hücrelerinin yayılımına olanak sağladığı, geçirgenliğin gözenek boyutu arttıkça artmasıyla kemik büyümesinin desteklendiği görülmüştür. Ancak gözenek boyutu ve miktarı ile mekanik güç arasında ters bir orantı bulunmaktadır. Bu sebeple mekanik anlamda güçlü sentetik polimerler ile yüksek gözeneklilik sağlayan ve hücre çoğalımı için çok daha elverişli bir ortam sunabilen doğal polimerler birlikte kullanılarak bu problemin önüne geçilebilir. Bu tezde farklı avantaj ve dezavantajlara sahip PCL ve lignin polimerleri bir karışım olarak kullanılarak ve bu karışımdan sünger yapılı gözenekli yapılar oluşturularak uygun bir kemik doku mühendisliği iskelesi eldesi hedeflenmiştir. Gözenekli sünger benzeri yapı iskeleleri oluşturmak için çözücü dökümü, parçacık uzaklaştırma ve dondurarak kurutma yöntemleri kullanılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda PCL ve lignin içeren iskele yapıları oluşturmak için farklı miktarlardaki polimerler kloroform/DMF (2:1, v/v) içerisinde çözdürülmüştür. PCL için 200 mg/ml konsantrasyonu sabit tutularak, 0, 10, 15 ve 20 mg/ml lignin içeren örnekler hazırlanmış ve sırasıyla; PCL200, PCL200/Lignin10, PCL200/Lignin15, PCL200/Lignin20 olarak adlandırılmıştır. Ayrıca PCL konsantrasyonun etkisinin araştırılabilmesi için 100 mg/ml PCL ve 20 mg/ml lignin içeren bir örnek de hazırlanmıştır (PCL100/Lignin20). Tüm bu örnekler için porojen olarak tuz (NaCl) partikülleri kullanılmıştır. Dondurma ve kurutma işlemlerinden sonra gözenekli yapı oluşturmak için seri yıkamalar ile tuz uzaklaştırılmıştır. Ek olarak porojen (tuz) kullanılmadan bir örnek hazırlanarak porojen kullanılan örneklerden farkının gözlemlenmesi amaçlanmıştır (PCL200/Lignin20/nS). Tüm PCL/Lignin iskelelerinin görsel olarak saf PCL iskelelerinden daha kahverengi olduğu gözlemlenmiştir. PCL konsantrasyonunun etkisinin gözlemlenmesi amacıyla oluşturulan PCL100/Lignin20 yapısında, örneğin sonraki deneylerde kullanımına imkan sağlayacak kadar bir yapısal bütünlük elde edilememiştir. PCL200/Lignin20/nS numunesinin dondurarak kurutma sonrasında kalıp yüzeyine yapıyı bozmadan çıkarılamayacak kadar yapıştığı gözlemlenmiş, organik çözücülerin kullanılması nedeniyle, örneğin kalıptan çıkmasını kolaylaştıracak başka bir kalıp tipi veya kalıp ile polimer çözeltisi arasında bir ara yüz kullanılması mümkün olmamıştır. Her iki yapı da başka deneylerde kullanılmaya uygun bulunmayarak çalışmadan çıkarılmıştır. Bu tezde iskelelerin mekanik özellikleri incelenmemiş olsa da, ön görsel ve manuel analizlere dayalı olarak PCL/Lignin iskelelerinin PCL yapılarından daha esnek olduğu gözlemlenmiştir. Su alma analizi sonucu, farklı lignin konsantrasyonları ile hazırlanmış örnekler arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. Ancak saf PCL örneği ile kıyasladığında örneklerin su alma davranışı lignin ilavesiyle çarpıcı biçimde artmıştır. Bir gün sonunda PCL200 için su alımı %44 iken lignin eklenen örneklerde %380-400 aralığında kaydedilmiştir. Doku mühendisliği iskelelerinin içindeki kimyasal bağlarının incelenebilmesi için Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) yapılmıştır. PCL için tipik pik noktaları, her iskele tipi için de gözlemlenmiştir. Lignin için özel pik noktaları elde edilememiş olsa da, tüm PCL/Lignin tipi iskelelerde, PCL'ye kıyasla, –OH gruplarını temsil eden pikin yoğunluğunda bir azalma tespit edilmiştir. Bunun, PCL ve lignin polimerleri arasında gerçekleşen reaksiyonlar ve yeni bağlar için bir kanıt olabileceği düşünülmüştür. İki analiz için de saf PCL numunesi ile ligninli numuneler arasında fark gözlemlenmesine karşın, farklı lignin konsantrasyonlarına sahip numuneler arasında kayda değer bir fark elde edilmemiştir. Bu nedenle, daha sonraki deneyler için lignin oranının en düşük olduğu örnek olan PCL200/Lignin10 ile devam edilmesine karar verilmiştir. PCL200 ve PCL200/Lignin10'un gözeneklilikleri, sıvı yer değiştirme yöntemiyle, sırasıyla %73 ve %76 olarak hesaplanmıştır. SEM görüntüleri üzerinde ImageJ yazılımı kullanılarak gözenek boyutları incelenmiştir. PCL200 iskelesinin yüzeyindeki gözeneklerin %31'i ve %58'i, PCL200/Lignin10 iskele yüzeyinin %30'u ve %43'ü, sırasıyla 100-300 µm ve 300-600 µm aralığında olarak bulunmuştur. Ayrıca 20 µm'den küçük birçok gözenek tespit edilmiştir. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre ile yapılan analizde PCL200/Lignin10 iskelesinin erime sıcaklığı PCL200 iskelesinden %5.4 daha yüksek elde edilmiştir. FTIR sonuçlarını destekler nitelikte artan erime sıcaklığının, PCL ve lignin arasında oluşmuş olabilecek yeni bağların sonucu olabileceği tahmin edilmektedir. Her iki numune için 7 günün sonunda hidrolitik bozunma gözlemlenmemiş olmasına karşın iki sünger için de lipaz varlığında enzimatik bozunma gözlemlenmiştir. Lignin eklentisi bulunan sünger örneğinin enzimatik bozunma hızının saf PCL'e kıyasla çok daha yavaş olduğu gözlemlenmiştir. PCL200/Lignin10 için 7 gün sonunda sadece %43 kütle kaybı kaydedilirken, PCL200 süngeri beşinci günden sonra tamamen bozunmaya uğramıştır. Ligninin enzimatik bozunmaya karşı olan doğal direncinin veya alkali lignin oluşturmaya yönelik yapılan modifikasyonların, bozunmadaki bu beklenmedik düşüşün nedeni olabileceği düşünülmektedir. İskelelerin modifiye-yapay vücut sıvısı (m-SBF) çözeltisine batırılmasıyla biyomineralizasyon süreci tetiklenmiştir. Süreci hızlandırmak için üç kat daha yoğun m-SBF kullanılmıştır. Süreç sonucunda oluşan hidroksiapatit-benzeri yapıların yoğunluğu SEM cihazı ile analiz edilmiştir. SEM görüntüleri, her iki örnek tipinde de 7. günün sonunda yüzeyde hidroksiapatit-benzeri yapıların yoğun bir şekilde biriktiğini göstermiştir. Örneklerin 7. gün sonuçları karşılaştırıldığında PCL200 örneğinde mineral yapılarının çoğunlukla birbiri üzerine biriktiği gözlemlenirken, PCL200/Lignin10 örneğinde bu birikmelerin yüzeye daha eşit bir şekilde yayılarak gerçekleştiği gözlemlenmiştir. Ek olarak, PCL200 örneğinin yüzeyinde gözlemlenen yoğun birikime rağmen porların iç yüzeylerinin birikme olmaksızın pürüzsüz bir yapıda olduğu tespit edilmiştir. Lignin içeren örneklerin por iç yüzeylerinde ise yüzeyde olduğu şekilde hidroksiapatit-benzeri yapıların birikimi gözlemlenmiştir. Oluşan hidroksiapatit benzeri yapıların element analizi EDX ile gerçekleştirilmiştir. Belirlenen tüm zamanlarda, PCL200/Lignin10 numuneleri üzerindeki birikimlerin Ca/P oranlarının ideal hidroksiapatit Ca/P oranına (1,67) daha yakın olduğu tespit edilmiştir. Son olarak, lignin ilavesinin iskele yapıları üzerinde çoğalabilecek hücre sayısı üzerindeki etkisinin incelenebilmesi için hFOB hücre hattıyla deneyler gerçekleştirilmiştir. hFOB hücre sayısı, PCL200'ye kıyasla PCL200/Lignin10 iskelelerinde önemli ölçüde daha yüksek olarak kaydedilmiştir. PCL200/Lignin10 süngeri üzerindeki proliferasyonun 3. ve 7. günlerde sırasıyla %212 ve %50 daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. PCL200/Lignin10 sünger yapı iskelelerinin kemik doku mühendisliğinde kullanılabilirliğini değerlendirmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Ancak bu tez kapsamında elde edilen bulgular, elde edilen yapının umut vadettiğini göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Organs and tissues may be damaged by accident, congenital anomalies, diseases and similar reasons. Although living tissues have the capacity to heal these damages, large defects or severe tissue losses can only be repaired to a certain extent. Tissue engineering techniques have been developed to trigger, assist and accelerate the healing process, or directly replace the targeted tissue. In tissue engineering, the most suitable three-dimensional scaffold structure is produced to match the characteristics of the targeted tissue and provide the initial structural integrity and organizational backbone for cells to replace the damaged tissues and organs. Especially bone and its related diseases can cause a significant impact on a person's health and quality of life if they are not treated and healed properly. Millions of bone injuries have been occurring each year and they are not only affecting people's life but also cause to a serious burden on country's economies. Bone tissue engineering was presented as a solution to address these problems. In this thesis, a synthetic and natural polymer blend was used to create a scaffold that is suitable for bone tissue engineering. Polycaprolactone (PCL) was used as synthetic polymer, while alkaline lignin was used as natural polymer. Solvent casting, particulate leaching and freeze-drying methods were used to create porous sponge-like scaffolds. PCL and lignin samples were prepared at different lignin concentrations (0, 10, 15, and 20 mg/ml) while keeping the PCL concentration constant at 200 mg/ml, PCL200, PCL200/Lignin10, PCL200/Lignin15 and PCL200/Lignin20, respectively. A sample with PCL concentration of 100 mg/ml and lignin concentration of 20 mg/ml was also prepared to see the effect of PCL concentration (PCL100/Lignin20). For all scaffolds, except for the control sample, NaCl crystals were used as porogen. Lignin containing scaffolds were appeared more brownish than pure PCL scaffolds. Since the structural integrity of PCL100/Lignin20 sample was very poor, and PCL200/Lignin20 without the salt addition cannot be removed from the mold surface, they were not used in further experiments. Even though, mechanical properties of the scaffolds have not been studied in this thesis, based on preliminary visual and manual analysis rest of the PCL/Lignin type scaffolds were observed to be more flexible than PCL constructs. Water uptake analysis showed that there is no significant difference between the samples with different lignin concentrations. The water uptake behavior of the scaffold, however, was dramatically increased with the lignin addition. While the water uptake for PCL200 was 44%, it was 380-400% for the samples with lignin after 24 h. In Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) analysis, typical peaks for PCL are identified for all scaffold types. Even though special peaks for lignin could not be observed, a reduction in the intensity of a peak, which represent –OH groups, was determined in all PCL/Lignin scaffolds compare to the PCL200. This can be evidence of reactions and new bonds between PCL and lignin polymers. Since water uptake and FTIR analysis showed that there is no significant difference between different lignin concentrations, it was decided to continue with only one sample type, PCL200/Lignin10, for further experiments. The porosities of pure PCL200 and PCL200/Lignin10 determined as 73% and 76%, respectively using liquid displacement technique. Pore sizes were investigated with ImageJ software on SEM images. For PCL200 scaffold, 31% and 58% of the pores on the surface were in the range of 100-300 µm and 300-600 µm, respectively. For PCL200/Lignin10, 30% and 43% of the pores were in the range of 100-300 µm and 300-600 µm, respectively. In addition, many pores that are smaller than 20 µm were observed for both sponges. The melting temperature of PCL200/Lignin10 scaffold was %5.4 higher than PCL200 scaffold as determined by Differential Scanning Calorimetry. The increased melting point might be the result of a new bond between PCL and lignin. Hydrolytic degradation was not seen within 7 days for both samples, but enzymatic degradation in lipase presence was observed for both sponges. After 7 days, only 43% weight loss was recorded for PCL200/Lignin10, while PCL200 sponge was completely degraded after the fifth day. Lignin's natural resistance to enzymatic degradation or the modifications to form an alkaline lignin might be the reason of this unexpected decrease in degradation. Biomineralization process was triggered by soaking scaffolds to modified-simulated body fluid solution. The mineralization rate was analyzed by SEM. SEM micrographs revealed significant mineral accumulations for both scaffold types at the end of the 7th day. When the 7th day samples were compared, it was seen that the hydroxyapatite-like structures were mostly deposited on top of each other in the PCL200 sample, while the aggregations were more evenly spread over the surface on the PCL200/Lignin10 sample. Furthermore, even though an intense accumulation was observed on the scaffold surface of the PCL200, the inside of the pores as appeared to be smooth. Lignin containing samples, on the other hand, had more mineral deposition within the pores. The elemental analysis of the formed hydroxyapatite-like structures was analyzed by EDX. It was observed that the Ca/P ratio of the accumulations on the PCL200/Lignin10 samples at all determined times was closer to the ideal hydroxyapatite Ca/P ratio (1.67). Finally, cell proliferation assay was performed with hFOB cells to examine the effects of lignin addition on cell adherence and proliferation on the surface. The proliferation of hFOB was significantly higher on PCL200/Lignin10 scaffolds compared to PCL200. The proliferation on PCL200/Lignin10 sponge was found to be 212% and 50% higher after day 3 and 7, respectively. Further studies are necessary in order to evaluate the usability of PCL200/Lignin10 sponge scaffolds in bone tissue engineering. However, the findings obtained within this thesis suggest that this blend is promising candidate for bone tissue engineering.
Benzer Tezler
- PCL/halloysit film hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of PCL/halloysite film
GÜLCE ÇAKMAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
Kimya MühendisliğiGazi ÜniversitesiKimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURSEL DİLSİZ
- Preparation and characterization of polymeric blends of poly(E-caprolactone)and poly(P-chlorostyrene)
Başlık çevirisi yok
HASAN HÜSEYİN ENGİN
- Biyoaktif cam ve hidroksiapatit içeren polikaprolakton nanoliflerin elektroeğirme yöntemi ile hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of bioactive glass and hydroxyapatite containing polycaprolactone nanofibers by electrospinning method
RABİA KONYALI EKEN
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
Metalurji MühendisliğiManisa Celal Bayar ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. AYLİN MÜYESSER DELİORMANLI
- Polimer karışımları kullanılarak nanokompozit jellerin hazırlanması, karakterizasyonu ve biomedikal uygulamaları
Preparation and characterization of nanocomposite gels using polymer blends and biomedical applications
DARİUSH NİKJOO
- Propolis yüklü polimerik nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu, immünomodülatör etkilerinin makrofaj hücrelerinde incelenmesi
Preparation and characterization of propolis-loaded polymeric nanoparticles, investigation of their immunomodulatory effects on macrophage cells
TOGHRUL SADIKHOV
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Biyomühendislikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
PROF. DR. ADIL ALLAHVERDIYEV
