Geri Dön

Pluripotent stem cell (IPSCs)-derived hepatic organoids for modeling liver cancer

Karaciğer kanserinin modellenmesinde indüklenebilir pluripotent kök hücre (IPSCs) kaynaklı hepatik organoidler

PDF İndir

  1. Tez No: 734381
  2. Yazar: MUSTAFA KARABİÇİCİ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Onkoloji, Biology, Oncology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
  10. Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 107

Özet

Karaciğer kasnseri, dünyada ölüm sıralamasında 4. sırada yer alan, tedavi seçenekleri çok sınırlı heterojen bir hastalıktır. En sık görülen tipi olan Hepatosellülar Karsinoma (HCC) genellikle siroz temelinde gelişen, geç tanı ve ilaç direnci ile karakterize bir kanserdir. HCC'de erken moleküler patofizyolojik değişikliklerin anlaşılmasında ve yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesinde en önemli sınırlılık, insan tümör oluşumunu taklit eden in vitro ve in vivo modellerin eksikliğidir. Bu kapsamda İPSC lerden üretilen hepatositlerde mikroçevrenin stemness ve senesens morfolojisindeki etkileşimleri incelenmiş olup (Karabicici, 2021) karaciğer kanserinin fibroz ve siroz gibi malign öncesi evrelerinin oluşumunu ve gelişimini modelleyen uzun vadeli ve büyük ölçekli bir 3D hücre kültürü modeli geliştirmek amaçlanmıştır. Bu kapsamda, İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (İPSCs) kaynaklı sağlıklı organoidlerde (eHEPO) en yaygın olarak mutasyona uğradığı bildirilen 3 driver genin (p53, APC ve NF1) hedeflenen gen modifikasyonu için CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılmıştır. Bu driver genleri hedefleyen CRISPR/Cas9 stratejisi, HEK293T hücrelerinde başarılı bir şekilde çalışmış olsa da, bu tez kapsamında yalnızca p53 KO eHEPO ların kanser tümör mikroçevresindeki yanıtları incelenmiştir. Bunun için p53'e özgü gRNA içeren px458 plazmitleri optimize edilmiş Nucleofector koşulları aracılığıyla eHEPO'lara transfekte edilmiştir. Sonrasında elde edilen GFP+ hücreler FACS ile ayrımlandıktan sonra, Nutlin-3a selektif ortamı içerisinde büyüyebilen p53 KO eHEPO klonları manuel olarak seçilmiştir. Pro-kanserojenik TME yi taklit etmek için aktive edilmiş LX2 ve M2 polarize hücre sekretomları, WT kontrollerinin yanı sıra p53 KO-eHEPO'ların büyüyen ortamına ilave edilmiştir. Bu işlem sonrasında P53-KO eHEPOlarda artmış proliferasyonun yanısıra (Ki67) artan nükleer-sitoplazmik oran, pleiomorfik ve hiperkromatik çekirdekler, psödo glandüler ve tübüler rozetler ve inflamatuar benzeri hücre morfolojisi dahil olmak üzere, prokarsinogenik tümör markerları gözlenmiştir. Ayrıca mason trichome boyanan alan ve fibrotik gen ekspresyonlarının önemli ölçüde arttığı gösterilmiştir. Sonuç olarak, HCC başlangıcındaki driver genlerden biri olan p53 KO eHEPO kullanılarak pro kanserojen bir mikroçevrede tümör oluşum mekanizmalarının anlaşılmasına önemli katkılar sağlayacak fibrotik bir organoid modelinin oluşturulabileceği gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

Liver cancer is a heterogeneous disease with very limited treatment options, which ranks 4th in the world in terms of death. Hepatocellular Carcinoma (HCC), the most common type, is cancer that usually develops on the basis of cirrhosis and is characterized by late diagnosis and drug resistance. The most important limitation in understanding the early molecular pathophysiological changes and identifying new treatment targets in HCC is lack of the in vitro and in vivo models mimicking human tumorigenesis. In this context, in this study, the interactions of the microenvironment with stemness and senescence morphology in hepatocytes produced from IPSCs were investigated (Karabicici, 2021) and it was aimed to develop a long-term and large-scale 3D cell culture model that models the formation and development of pre-malignant stages of liver cancer such as fibrosis and cirrhosis. Here we utilize CRISPR/Cas9 technology for targeted gene modification of three of the most commonly mutated liver cancer genes (p53, APC, and NF1) in Induced Pluripotent Stem Cell derived healthy organoids (eHEPO). Although the CRISPR/Cas9 strategy to make these driver genes knockout has been worked successfully in HEK293 cells, we only continued with p53 knockout on eHEPOs. For this, we firstly transfected px458 plasmids containing p53 specific gRNA to the eHEPOs via optimized Nucleofector conditions. After enrichment of the GFP+ cells by FACS, we manually selected p53 KO-eHEPO clones under Nutlin-3a treatment. To mimic pro-carcinogenic TME activated LX2 and M2 polarized cell secretoms were added to growing medium of p53 KO-eHEPOs as well as WT controls. P53-KO highly proliferative (Ki67) and all displayed features of pro-carcinogenic pathological marks of pre-malign stages including increased nuclear–cytoplasmic ratio, pleiomorphic and hyperchromatic nuclei, pseudo glandular and tubular rosettes and inflammatory-like cell morphology. In addition, mason trichome staining area and fibrotic gene expressions have been shown to increase significantly. As a result, it has been shown that a fibrotic organoid model can be created that will make significant contributions to the understanding of tumor formation mechanisms in a carcinogenic microenvironment by using p53 KO-eHEPOs, which is one of the driver genes at the onset of HCC.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    521409

    İn-vitro hepatik organoid modelinin geliştirilmesi

    Development of in-vitro hepatic organoid model

    SOHEIL AKBARI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Endokrinoloji ve Metabolizma HastalıklarıDokuz Eylül Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK

    PROF. DR. NUR ARSLAN

  2. Tez No

    613881

    Modelling hTERT cancer-associated mutations via crispr-Cas9 in 3d liver organoids

    Kanser ilişkili hTERT mutasyonlarının 3d karaciğer organoidlerinde crıspr-Cas9 ile modellenmesi

    CANAN ÇELİKER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK

    DOÇ. DR. ŞERİF ŞENTÜRK

  3. Tez No

    648508

    Generation of induced pluripotent stem cell (iPSCs)-based models of Friedreich's Ataxia (FRDA)

    Başlık çevirisi yok

    SİMGE KELEKÇİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    Moleküler TıpKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER

  4. Tez No

    605439

    İnfantil osteopetrozisli hasta uyarılmış pluripotent kök hücreleri ile osteoklast defektinin modellenmesi, osteoklast ve hematopoietik niş ilişkisi

    Modelling osteoclast defect with patient derived induced pluripotent stem cells, osteoclast and hematopoietic niche intractions in infantile osteopetrosis

    İNCİ CEVHER ZEYTİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    HematolojiHacettepe Üniversitesi

    Kök Hücre Bilim Dalı

    DOÇ. DR. FATMA VİSAL OKUR

  5. Tez No

    575418

    KCNQ1 geni CRISPR/CAS9 sistemi ile düzenlenmiş insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin karakterizasyonu

    Characterization of crispr/CAS9 edited kcnq1 gene variants in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

    TUĞCE TORUN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Genetikİstanbul Medipol Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ESRA ÇAĞAVİ

Geri Dön