The study of colorimetric pH probe and optical detection of heme attachment to cyt C by using genetically encoded indicators in living cells
Kolorimetrik pH ölçer çalışması ve genetikle kodlanan floresan indikatörlerle sitokrom C konformasyonlarının belirlenmesi
- Tez No: 737686
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HALİL BAYRAKTAR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Biology, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 115
Özet
Sitokrom c (Cyt c), kofaktör olarak içerisinde heme sahip metalik bir proteindir. Hem, yapısının merkezinde indirgenmiş bir demir atomuna (Fe2+) sahiptir. Fe2+ atomu, tiyoeter bağlarının oluşumu için önemlidir. Tiyoeter bağları, Cyt c'nin katlanmamış formları olan apositokrom c'nin (Apocyt c) Cys18 ve Cys15 rezidülerinin tiyol grupları ile heme'nin vinil grupları arasında holositokrom c sentetaz (HCCS) veya sitokrom c hem liyaz (CCHL) tarafından katalizlenmesiyle oluşturulur. Daha sonra holositokrom c veya Cyt c, Met81 rezidüsü ile katlanarak olgun haline döner. Cyt c'nin insan hücrelerinde iki ana işlevi vardır. Bunlardan biri, solunumda oksijeni suya indirgemek için önemli bir adım olan elektron transfer sisteminde (ETS) Cyt bc1'den Cyt c oksidaza elektron aktarmaktır. Diğer bir işlevi apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 (Apaf-1) kompleksine bağlanarak apoptozun intrinsik yolağındaki kaspazları aktive etmektir. Cyt c, kromozom 7'nin 7p15.3 bölgesinde yer alan CYCS geninde kodlanır. Megakaryositlerde G41S'nin CYCS genindeki yer değiştirme mutasyonu, trombositopeni adı verilen otozomal dominant genetik bozuklukla sonuçlanır. Bu durumda trombositler prematüre formlarında apoptoza girerek olgun formlarını oluşturamazlar ve herhangi bir işlev göremezler. CCHL, X kromozomunun Xpter bölgesinde yer alan ve evrimsel olarak korunmuş bir gen olan HCCS geninde kodlanmıştır. Xpter'in Xp22'ye yeniden düzenlenmesi, lineer cilt kusurları sendromu (MLS) ile mikroftalmi olarak adlandırılan bir nörogelişimsel genetik bozuklukla sonuçlanır. MLS erkeklerde sadece bir X kromozomu olduğu için doğum öncesi öldürücüdür, dişilerde ise iki X kromozomu vardır ve hastalığı rastgele X inaktivasyonu nedeniyle fenotipte gösterirler. Cyt c özelllikleri ve fonksiyonları çeşitli yöntemlerle tespit edilir. İmmünoblotlama, enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) ve akış sitometrisi immünolojik yöntemleri kullanılarak Cyt c ile karaterizasyonu ile çok çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Bu yöntemler, Cyt c'yi tespit etmek için spesifik antikorlar kullanır. Dairesel dikrorizm (CD), hidrojen/döteryum (H/D) değişimi, fourier transform kızılötesi (FTIR), jel filtrasyonu ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (IATC) kullanarak Cyt c'un yapısal değişiklikleri ile ilgili çalışmalar yapılmıştır. Bu tekniklerin tümü, Cyt c'yi in vitro'da tespit etmek için faydalı olsa da, Cyt c'nin yapısal değişimlerini in vivo'da özellikle yaşayan hücrelerde gerçek zamanlı olarak tespit etmek için kullanışlı değildir. Genetik olarak kodlanmış floresan probları canlı hücrelerde ve organizmalarda hücresel işlevleri gerçek zamanlı olarak görüntülemeye imkan sağlar. Yeşil floresan proteini (GFP), Aequorea victoria'dan izole edilen ilk proteindir. Genetik mühendisliği ve moleküler klonlama teknikleri ile, kırmızı floresan proteini (RFP), açık mavi (cyan) floresan proteini (CFP), sarı floresan proteini (YFP), ve Venüs gibi çeşitli floresan proteinleri zamanla geliştirildi. Bu proteinler hücre biyolojisi çalışmaları için farklı özelliklere ve farklı renklere sahiptir.Floresan protein geni bir vektöre klonlanır ve istenen protein geni de floresan protein geninin yukarısında veya aşağısında klonlanır. Daha sonra vektör, bakteri veya hücre hattı gibi hücreye aktarılır ve hücrede rekombinant olarak in vitro ortamda eksprese edilir. Daha sonra, spektroskopik tekniklerle karakterize edilir ve lazer mikroskobu ile gerçek zamanlı olarak in vivo ortamda hücresel fonksiyonları takip etmek için kullanılırlar. Floresan rezonans enerji transferi (FRET) sistemi, iki tür floresan proteini kullanan bir tür genetik olarak kodlanmış floresan probudur. Bunlardan biri istenen proteinin yukarısına yerleştirilen alıcıdır. Bir diğeri, istenen proteinin aşağısına yerleştirilen donördür. Aslında ligand bağımlı FRET probları ve katalitik problar gibi farklı FRET türleri vardır. Örneğin, alıcı (CFP) ve verici (YFP) proteinler arasında bir sensör domaini vardır. Bir ligand sensör domainine bağlanırsa, konformasyonel bir değişiklik meydana gelir ve alıcı ve vericinin birbirine yaklaşmasıyla sonuçlanır. Bu durumda, alıcı lazer mikroskobundan belirli bir dalga boyunda gelen sinyali emer ve verici alıcıdan gelen sinyali söndürerek, dedektöre bir FRET sinyali yayar. Eğer ortamda ligand yoksa, konformasyonel değişim olmaz ve bunun sonucunda FRET sinyali oluşmaz. Sadece alıcıdan yayılan sinyal algılanır. Bu çalışmada, ilk olarak Cyt c-Venüs adlı bir FRET yapısını kolorimetrik ve rasyömetrik pH probu olarak tanımladık ve Cyt c ve Apocyt c-Venüs olan diğer kontrol yapıları ile karşılaştırdık. Bu yapılar, önceki çalışmamızda rekombinant klonlama yöntemleriyle tasarlandı, ancak karakterize edilmediler. Bu yapıları BL21 DE3 E.coli bakteri hücrelerinde ifade ettik ve pH 4.5, 5.5, 6.5, 7.5 ve 8 PBS tamponları ile yıkadık. Cyt c-Venüs ve Apocyt c-Venüs'ün görünür ışık altında renklerinde değişiklikler olduğunu pH 8'den 4.5'e düştüğü zaman gözlemledik. Öte yandan, Cyt c'in renginde pH düşse bile değişiklik olmadığını gözlemledik. Cyt c-Venüs ve Apocyt c-Venüsün pH 8 ve 7.5'te floresan parlaklıkları olduğunu UV ışık altında gözlemledik, ancak Cyt c-Venüs ve Apocyt c-Venüs'ün floresanları pH 6.5, 5.5 ve 4.5'te kayboldu, oysa Cyt c'de UV ışığı altında Venüs veya floresan proteini olmadığı için tüm pH değerlerinde floresan parlaklığı olmadığını gözlemledik . Bu proteinlerin absorbansları spektrofotometre ile ölçüldü. Cyt c-Venus'ta pH 8 ve 7.5'te iki sinyal tepe noktası olduğunu gözlemledik. Biri Cyt c'e ait 408 nm'de, diğeri Venüs'e ait 515 nm'de. Venüs'ün Cyt c-Venüs'teki sinyal tepe noktası pH düştükçe azalmaya başlamış ve pH 4.5'te kaybolmuştur. Diğer yandan, tüm pH değerlerinde Cyt c'nin sinyal zirvesinde değişiklik yoktur. Absorbans grafiklerinde düzgün tepe noktaları elde etmek ve hücresel atıklardan kaynaklanan arka plan sinyallerini önlemek için hücreleri parçaladık ve proteinleri diğer hücresel atık bileşenlerinden iyon değişim kromatografisiyle saflaştırdık. Ardından proteinleri SDS-PAGE'de yürüterek büyüklüklerine göre ayırdık. Cyt c ve Cyt c-Venüs'ü saflaştırdık. Daha sonra saf Cyt c-Venüs proteinini derişik olmayan HCI damlatarak titre ettik. Cyt c ve titre edilmemiş Cyt c-Venüs'e kıyasla titre edilmiş Cyt c-Venüs'te bir renk değişimi olduğunu gözlemledik. Aslında, Cyt c-Venüs'ün renginin, Venüs'ün pH'a duyarlılığı nedeniyle, görünür ışık altında asidik pH'da turuncudan kırmızıya dönmesini bekliyorduk. Kırmızıya dönmese de turuncu rengini kaybettiğini gözlemledik. UV ışığı altında parlak bir flöresansa sahip titre edilmemiş Cyt c-Venüs ile ve herhangi bir flöresansı olmayan Cyt c ile karşılaştırıldığında flöresansını da kaybetti. Titrasyon sırasında Cyt c-Venüs'ün absorbansını veya eksitasyonunu ölçtük ve Venüs'ün 515 nm'de sinyal tepesinde azalma olduğunu ve sonunda düşük pH değerlerinde sinyal tepesini kaybettiğini gözlemledik. 408 nm'de Cyt c'nin sinyal tepesinde herhangi bir değişiklik gözlemlenmedi. Ayrıca kontrol olarak derişik olmayan HCI ile saf Cyt c'yi titre ettik ve Cyt c'nin renginde, floresansında ve absorbsiyon sinyalinde herhangi bir değişiklik gözlemlemedik. İkinci olarak, Cyt c'nin heme bağlanmasını ve yapısal değişikliklerini gerçek zamanlı olarak canlı hücrelerde takip etmek amacıyla Cyt c geninin yukarısına alıcı olarak bir Cerulean geni ve donör olarak Cyt c geninin aşağısına bir Venüs geni yerleştirerek bir FRET probu tasarladık. Daha sonra yapıyı nöronal RPE hücrelerde ifade ettik. Arka plan sinyallerini hariç tutmak için netFRET değerlerini hesapladık ve netFRET değerlerini 0 ile 1 arasındaki normFRET değerlerine normalize ettik. Ayrıca Cerulean ve Venus arasında 17 amino asit bağlayıcıya sahip C17V'yi pozitif kontrol olarak kullandık. Hem ve hem liyaz varlığında Cerulean-Apocyt c-Venüs yapısında FRET sinyali de bulunan C17V'ye kıyasla FRET sinyali olduğunu gözlemledik. Ayrıca sadece hem varlığında Cerulean-Cyt c-Venüs'de FRET sinyali olduğunu gözlemledik. Öte yandan, hem liyaz yokluğunda hem yokluğunda veya sadece hem liyaz varlığında Cerulean-Apocyt c-Venüs yapısında FRET sinyali olmadığını gözlemledik. Burada hem liyaz'ın hem olmadığında Cyt c konformasyon değişimine yol açmadığı sonucuna vardık. Hem konsantrasyonu arttıkça Cerulean-Apocyt c-Venüs'de FRET sinyalinin arttığını gözlemledik. Ayrıca Cerulean ve Venüs'yi ayrı ayrı ifade ettik ve FRET sinyalini hem varlığında C17V ile karşılaştırdık. Hemin C17V'ye bağlanmadığını gözlemledik. Sonuç olarak Cyt c-Venüs'ün pH'a duyarlı olduğunu karakterize ettik ve bunun pH değişikliklerini gerçek zamanlı olarak görüntülemesinde kullanışlı olabileceğini gösterdik. Cyt c konformasyon değişimlerinin hücre içerisinde gözlemlenmesi için FRET metodunun kullanımı ve analizini bu çalışmamızda gösterdik. Ayrıca, hem liyaz yokluğunda hemin Cyt c'ye kovalent olmayan bir şekilde bağlanabildiğini ve Cyt c'de konformasyonel değişikliklere neden olduğunu hassas FRET yöntemiyle gösterdik.
Özet (Çeviri)
The cytochrome c (Cyt c) is a metalloprotein that has a heme as a cofactor. The heme has a reduced iron atom (Fe2+) on the center of its structure. The Fe2+ atom is important for formation of thioether bonds. The thioether bonds are formed between the thiol groups of Cys18 and Cys15 residues of apocytochrome c (apocyt c) that is unfolded forms of Cyt c and the vinyl groups of heme by catalyzing of holocytochrome c synthase (HCCS) or cytochrome c heme lyase (CCHL). Met81 coordination change also affects the folding of Cyt c. The Cyt c has two main function in human cells. One of them is to transfer the electron from Cyt bc1 to Cyt c oxidase in electron transfer system (ETS) which is an important step to reduce oxygen to water in respiration. Another function is to bind apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) complex to activate caspases in intrinsic pathway of apoptosis.The Cyt c is encoded in CYCS gene which is located on 7p15.3 region of chromosome 7. The substitution mutation of G41S on CYCS gene in megakaryocytes results in an autosomal dominant genetic disorder called thrombocytopenia. In this case, the platelet cannot form their mature forms due to enter apoptosis in their premature forms and does not have a function. The CCHL is encoded on HCCS gene which is located on Xpter region of X chromosome and is an evolutionary conserved gene. The rearrangement of Xpter to Xp22 results in a neurodevelopment genetic disorder called as microphthalmia with linear skin defects syndrome (MLS). The MLS is lethal for males since they have only one X chromosome, whereas the females have two X chromosome and they show the disease in phenotype due to random X inactivation. The Cyt c is detected and studied by various biological methods. The Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and flow cytometry are extensively used to understand the role of Cyt c in cells. These methods use specific antibodies to detect Cyt c. Circular dichroism (CD), the hydrogen/deuterium (H/D) exchange, the Fourier transform infrared (FTIR), gel filtration and the isothermal titration calorimetry (IATC) are spectroscopic techniques that were used to study the structural changes of Cyt c. Although all of these techniques are sensitive to detect Cyt c in vitro, they are not useful to study conformational changes Cyt c in vivo especially in living cells at spatial and temporal resolution.The genetically encoded fluorescence probes enable to visualize cellular functions in living cells and organisms in real time. The green fluorescence protein (GFP) is the first isolated protein from Aequorea victoria. The fluorescence protein gene is cloned into a vector and the desired protein gene is also cloned upstream or downstream of fluorescence protein gene. Then, the vector is transformed into the cell such as a bacteria or cell line and expressed in the cell recombinantly. Then, the fluorescence probe characterized by spectroscopic techniques and used to follow cellular functions in vivo in real time by light microscope. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) system is a kind of genetically encoded fluorescence probe that uses two different fluorescence proteins. One of them is the acceptor that is placed to upstream of the desired protein. Another is the donor that is placed to downstream of the desired protein. There are actually different types of FRET such as ligand-dependent FRET probes and catalytic probes. For example, there is a sensor domain between acceptor (CFP) and donor (YFP) proteins. If a ligand binds to sensor domain, there is a conformational change occurs and results in the approaching of acceptor and donor with each other. In this case, the acceptor absorbs the signal from laser microscope and the donor quenches the signal from acceptor, emits a FRET signal to detector. In this study, we firstly characterized a FRET construct called Cyt c-Venus as a colorimetric and ratiometric pH probe and compared to the other control constructs which are Cyt c and Apocyt c-Venus. These constructs were designed by recombinant cloning methods in our previous study, but their pH sensitivity were not characterized in detail. We expressed these constructs in BL21 DE3 E.coli bacterial cells and treated with pH 4.5, 5.5, 6.5, 7.5 and 8 PBS buffers. We observed that there are changes in the colors of Cyt c-Venus and Apocyt c-Venus, but there is no change in the color of Cyt c under visible light, as the pH declines from 8 to 4.5. We observed fluorescences of Cyt c-Venus and Cyt c in pH 8 and 7.5, but the fluorescence of Cyt c-Venus and Apocyt c-Venus were diminished in pH 6.5, 5.5 and 4.5, whereas there is no fluorescence in Cyt c in all pH values since it does not have fluorescence protein under UV light. The absorbances of these proteins were measured by UV-Vis spectrophotometer. We observed that there were two signal peaks in Cyt c-Venus in pH 8 and 7.5. One of them is at 408 nm which belongs to Cyt c, another is at 515 nm which belongs to Venus. The signal peak of Venus in Cyt c-Venus started to decrease, as the pH reduced and it was disappeared in pH 4.5. On the other hand, we did not observe any change in the signal peak of Cyt c in all pH values. To get smooth peaks in absorbance graphs and prevent background signals due to cellular wastes, we lysed the cells and purified the proteins by ion-exchange chromatography from other cellular waste components. Then, we run the proteins in SDS-PAGE. We successfully purified Cyt c and Cyt c-Venus. We titrated the pure Cyt c-Venus protein by dropping mild HCI. We had observed that there was a color change in Cyt c-Venus compared to Cyt c and non-titrated Cyt c-Venus. Indeed, we had expected that the color of Cyt c-Venus turned from orange to red at acidic pH under visible light due to sensitivity of Venus to pH. Although it did not turn to red, orange color was reduced. We also observed a decline in its fluorescence compared to non-titrated Cyt c-Venus that had a brilliant fluorescence under UV light and compared to Cyt c that did not have any fluorescence. We measured the absorbance or excitation of Cyt c-Venus during titration and observed that there was a decline of signal peak of Venus at 515 nm and it finally disappeared at low pH values. There was no change at the signal peak of Cyt c at 408 nm. We also titrated pure Cyt c by mild HCI to use as a control and observed no change in the color, fluorescence and absorption signal of Cyt c.Secondly, we also investigated the heme binding properties and conformational changes of Cyt c by design a FRET probe. We placed a CFP on upstream of Cyt c as acceptor and a YFP on downstream of Cyt c as donor. Then, we expressed the construct in neuronal RPE cells.We calculated the netFRET values to exclude background signals and we normalized the netFRET values to normFRET values which are between 0 and 1. We also used C17V as positive control which has a 17 amino acid linker between Cerulean and Venus. We observed that there was a FRET signal in Cerulean-Cyt c-Venus construct in the presence of heme and heme lyase compared to C17V which has also FRET signal. We observed that there was an increase in FRET signal in Cerulean-Apocytc-Venus in the presence of only heme. On the other hand, there was no FRET signal in Cerulean-Apocytc-Venus construct in the absence of heme and heme lyase or in the presence of only heme lyase. As the concentration of heme increased, we observed that the FRET signal increased in Cerulean-Apocytc-Venus. The expression of heme lyase in the absence of heme did not change the FRET signal indicating that heme is important for binding of heme lyase and Cyt c. As a control, we separately expressed Cerulean and Venus and compared the FRET signal to C17V in the presence of heme. We observed that the heme did not bind to C17V.As a conclusion, we have characterized that the Cyt c-Venus is a sensitive protein construct to pH changes. It can be used to visualize pH changes in real time. We have used FRET method to determine the intermediate state of Cyt c in RPE cells. We have also found that the heme can bind to Cyt c non-covalently in the absence of heme lyase and causes conformational changes in Cyt c by using FRET method.
Benzer Tezler
- Metal türlerinin tayini için karbazol temelli floresans sensörlerin geliştirilmesi ve uygulamaları
Development of carbazole based fluorescence sensors for determination of metal species and applications
SÜMEYYE ARSLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiKaramanoğlu Mehmetbey ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TAHİR SAVRAN
- Nanoyapılı maddeler yardımı ile enerjetik materyallerin tayini
Determination of energetic materials tith the aid of nanostructured substances
ZİYA CAN
- Metiyonin biyomolekülü ile modifiye edilmiş kromenilyum -siyanin floresan probun sentezi, çevrede ve canlı hücrelerde cıva(II) analizi uygulamaları
Synthesis of a methionine biomolecule-modified chromenylium-cyanine fluorescent probe and its application of mercury(II) analysis in the environment and living cells
YUSUF ALÇAY
- Synthesis of new hydrazide-based phenolphthalein and rhodamine B derivatives and investigation of their photophysical properties
Yeni hidrazit temelli fenolftalein ve rhodamin B türevlerinin sentezi ve fotofiziksel özelliklerinin araştırılması
ABDULLAH SALEH HUSSEIN HUSSEIN
Doktora
İngilizce
2024
KimyaBingöl ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MAHMUT TOPRAK
DOÇ. DR. SİNAN BAYINDIR
- Sarıçay, Karamenderes, Tuzla ve Kocabaş çaylarının (Biga Yarımadası-Marmara, Türkiye) Oligochaeta (Annelida) ve Chironomidae (Diptera) faunasının mevsimsel değişimlerinin araştırılması
The investigation of seasonal variations of Oligochaeta (Annelida) and Chironomidae (Diptera) fauna in Sarıçay, Karamenderes, Tuzla and Kocabaş streams (Biga Peninsula-Marmara; Turkey)
SERPİL ODABAŞI
Doktora
Türkçe
2013
Su ÜrünleriÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiSu Ürünleri Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NAİME ARSLAN
PROF. DR. SEMRA CİRİK