Hemofili A gen tedavisi için transgenik kök hücre platformunun geliştirilmesi ve in vitro etkinliği
Development and in vitro efficacy of transgenic stem cell platform for hemophilia A gene therapy
- Tez No: 739574
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF SİBEL ASLAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Biruni Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler ve Tıbbi Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 152
Özet
Hemofili hastalarının yaklaşık %80' ini etkileyen Hemofili A, Faktör VIII (FVIII) eksikliği sonucu gelişen X' e bağlı resesif kalıtımsal bir kanama bozukluğudur. Hastalar eklem içi ve kas içi kanamalarla ile karakterize olurken, faktör eksikliğinin derecesi, kanama sıklığını ve şiddetini belirlemektedir. Kanamanın kontrolü ve tedavisinde plazma türevli tedaviler ve rekombinant faktör konsantreleri kullanılmaktadır. Araştırmamızda Hemofili A hastalığından sorumlu olan FVIII eksikliğine yönelik gen tedavisi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda promotörü EF-1 alpha olan, B domaini silinmiş FVIII gen sekansı ile CD45 R0 truncated yüzey belirteci taşıyan (EF1α - FVIII.CC - CD45R0t) lentiviral vektör dizayn edilmiştir. Tasarladığımız lentiviral vektörün mezenkimal kök hücreleri transdükte etmesi sağlanarak immün cevaptan korunabilen, sahip olduğu yüzey belirteci (CD45R0t) sayesinde in vivo uygulamalarda takip edilebilen, toksik olmayan ve fonksiyonel FVIII sekresyonu sağlayabilen bir gen tedavisi hedeflenmiştir. Faktör VIII kodlayan lentivirüsün karakterizasyon ve kalite kontrol testlerinin ardından mezenkimal kök hücreler ile transdüksiyon verimliliği, FVIII kalıcılık ve ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. Faktör VIII proteinin varlığı Western Blot yöntemiyle de doğrulanmıştır. Geliştirilen lentivirüsün (LTR sekansı) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizleri ile replikatif olmadığı, güvenliliği test edilmiştir. FVIII sekresyonunun zamana bağlı değişimi Elisa yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktör VIII proteinin fonksiyonelitesi ise karıştırma testi (mixing test) ile aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) ve FVIII düzeyleri üzerinden gösterilmiştir. Zamana bağlı gerçekleştirilen FVIII sekresyon analizlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olmadığı, stabil seviyelerde FVIII varlığı saptanmıştır (p > 0.05). Karıştırma testi (mixing test) kullanılarak gerçekleştirilen analizlerde ise gen tedavisi uygulanmış ve gen tedavisi uygulanmamış FVIII içermeyen insan plazma ürünleri aPTT ve FVIII seviyesi açısından karşılaştırılmıştır. aPTT seviyeleri değerlendirildiğinde; gen tedavisi uygulanmamış gruba ait ortalamanın 92.69 ± 11.38 sn olduğu ancak gen tedavisi uygulanan grupta ise bu ortalamanın 38.60 ± 13.38 sn' ye düştüğü görülmüştür (p < 0.001). Faktör VIII seviyeleri değerlendirildiğinde ise gen tedavisi uygulanmamış grubun FVIII seviye ortalamasının 0.41 ± 0.03 IU/dL olduğu, gen tedavisi uygulanmış grubun ise FVIII seviye ortalamasının %25.41 ± 33.38 IU/dL' ye yükseldiği saptanmıştır (p < 0.01). Bu araştırma ile literatürdeki çalışmalara alternatif olarak Hemofili A gen tedavisinde yeni bir yöntemin geliştirilmesi sağlanmış, in vivo hayvan modelleri ve klinik denemelere katkı sağlayacak bir çalışmanın ilk adımları atılmıştır.
Özet (Çeviri)
Hemophilia A affecting approximately %80 of patients with hemophilia, is an X-linked recessive inherited bleeding disorder caused by deficiency of Factor VIII (FVIII) protein. While patients are presented with intra-articular and intramuscular bleeding, the degree of factor deficiency determines the frequency and severity of bleeding. Plasma- derived therapies and recombinant factor concentrates are used to control and treat the bleeding symptoms. The objective of this study is to design a gene therapy for FVIII deficiency, which is responsible for Hemophilia A. For this purpose, a lentiviral vector with EF-1 alpha promoter, B domain deleted Factor VIII gene sequence, and CD45 R0 truncated surface marker (EF1α - FVIII.CC - CD45R0t) was designed. The goal of the current study is to develop a gene therapy that can be secured from the immune response by transducing mesenchymal stem cells, can be tracked in vivo due to its surface marker (CD45R0t) and can provide non - toxic and functional FVIII secretion. After the characterization and quality control tests of FVIII encoding lentivirus, transduction efficiency with mesenchymal stem cells, FVIII persistence, and expression analyzes were performed. The presence of the FVIII protein was also confirmed by the Western Blot method. The lentivirus (LTR sequence) developed has been tested to be non-replicative, safe by polymerase chain reaction (PCR) analysis. Time-dependent alterations of FVIII secretion was evaluated using the Elisa method. The functionality of the factor VIII protein was demonstrated using mixing test through activated partial thromboplastin time (aPTT) and FVIII levels. There was no statistically significant difference in FVIII secretion over time, signifying that stable levels of FVIII were achieved (p > 0.05). In the mixing test analyses, FVIII deficient human plasma products with and without gene therapy were compared in terms of aPTT and FVIII levels. When aPTT levels were evaluated; it was observed that mean aPTT levels of the group that did not receive gene therapy was 92.69 ± 11.38 seconds, while the mean aPTT levels of the group that received the gene therapy were decreased to 38.60 ± 13.38 seconds (p < 0.001). When FVIII levels were evaluated, it was found that the mean FVIII level of the group that did not receive gene therapy was 0.41 ± 0.03 IU/dL, while the mean FVIII levels of the group that received gene therapy increased to 25.41 ± 33.38 IU/dL (p < 0.01). As an alternative to previous studies, the current study introduces a new method in Hemophilia A gene therapy, the first steps to contribute to in vivo animal models and clinical trials have been taken.
Benzer Tezler
- CRISPR-Cas9 Teknolojisi ile in Vitro F8 geninin fonksiyonunun bozulmasının sağlanması
Impairment of F8 Gene function in Vitro with CRISPR-Cas9 technology
MAHDI SHEKARI
Doktora
Türkçe
2023
BiyoteknolojiEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERİŞTAH FERDA ÖZKINAY
- Ağır Hemofili A hastalarında immün düzenleyici sitokinleri kodlayan gen polimorfizmlerinin inhibitör gelişimi ile ilişkisinin belirlenmesi
Determination of the relationship between gene polymorphisms encoding immune regulatory cytokines and inhibitor development in patients with severe hemophilia A
HUMAY MEHDIYEVA
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2021
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıEge ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TAHİR ATİK
- Molecular analysis of the factor IX gene in the Turkish population
Faktör IX geninin Türk toplumunda moleküler analizi
Ü.VENÜS ONAY
Doktora
İngilizce
1999
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. S. HANDE ÇAĞLAYAN
- Hemofili a hastalarında faktör VIII gen dizi incelenmesi
Factor VIII gene sequence investigation in patients with hemophilia a
DERYA EROL
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2023
HematolojiGaziantep Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. VAHAP OKAN
- Mutation profile of hemophilia A patients with inhibitors and association of interleukin and cytokine gene polymorphisms with inhibitor development
İnhibitörlü hemofili A hastalarının mutasyon profili ve interlökin ve sitokin gen polimorfizmleri ile inhibitör gelişimi ilişkisi
İNANÇ DEĞER FİDANCI