Analysis of sperm cytoplasmic mRNA content with special reference to the storage temperature and its possible impact on early embryonic development
Farklı saklama sıcaklığına bağlı olarak spermatozoonlarda sitoplazmik mRNA içeriğindeki değişimlerin erken embriyonik gelişim üzerine muhtemel etkileri
- Tez No: 746210
- Danışmanlar: PROF. DR. ALPASLAN GÖKÇİMEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Histoloji ve Embriyoloji, Histology and Embryology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 63
Özet
Amaç: Yardımcı üreme teknikleri, infertil çiftlerin gebe kalmaya yönelik tedavisinde kullanılan teknikler bütünüdür. Infertilite ise, bir yıl süren korumasız ve düzenli cinsel ilişkilerden sonrasında gebe kalmama durumudur. Yardımcı üreme teknikleri IVF, ICSI, kriyoprezervasyon, ilaç tedavisi gibi tıbbı uygulamaları kapsamaktadır. Yardımcı üreme tekniklerinin tarihi MÖ 2200 antik Mısır zamanına kadar uzanmaktadır. Tıbbi bir müdahale olan suni tohumlama ise 1784 yılında Spallanzani tarafından geliştirilmiştir. İnsanlarda ilk 'tüp bebek' olan IVF bebeği 25 Temmuz 1978'de İngiliz Oldham General Hastanesi'nde dünyaya gelmiştir. Bu başarıyı elde eden jinekolog Dr. Patrick Steptoe ve fizyolog Robert Edwards sonra da Nöbel Ödülüne layık görülmüştür. ICSI tekniği ise Gianpiero D. Palermo tarafından Brükseldeki Reprodüktif Tıp Merkezinde şans eseri olarak bulunmuştu. ICSI tedavisinden sonra ilk bebek 14 Ocak 1992'de doğmuştur. Türkiye'de ise ilk tüp bebek 02.05.1989 yılında Ege Üniversitesi Tüp Bebek Merkezinde doğmuştur. O yıllardan bu güne her yıl giderek artan sayıda çift infertilite nedeniyle tedavi olmaya başlamıştır. Günümüzde her 100 çiftten 20 si gebe kalma sorunlarını yaşamaktadır. 2015 yılında sadece Avrupa Birliğinde Yardımcı üreme tekniklerini kullanarak 157.500 bebek dünyaya gelmiştir. Bu rakamlar, yardımcı üreme tekniklerinin gittikçe artan önemini göstermektedir. Tıbbı teknolojinin gelişmesine rağmen Yardımcı üreme teknoloji alanında başarı oranları hala yüksek değildir. Teşhis konan infertilite vakaların yanı sıra 4 vakada 1 gibi yüksek oranda bilinmeyen başarısızlık söz konusudur. Yani, muhtemel unsurların (ovaryum, oviduct, uterus, x endometrium, oosit, sperm) sağlıklı görünmesine rağmen ortaya çıkan infertilite olguları görülmektedir. Son çalışmalar embriyo genomunun aktifleşmesine kadar zigot gelişiminde rol oynayan sitoplazmik mRNA ların önemine dikkat çekmektedir. Günümüze kadar bu mRNA ların oosit kaynaklı olduğunu, spermde hiç bulunmadığını var sayılmaktaydı. Fakat yeni bulgularına göre, sağlıklı spermatozoitlerin az miktarda sitoplazmaya sahip olduğu fertilizasyon sırasında da bunları zigotun içine getirdikleri belirlenmiştir (Miller, 2010). Bu durumda, maternal mRNA havuzuna az miktarda paternal mRNA da dahil olmaktadır. Yeni çalışmalara göre, sitoplazması olmayan sperm ile ICSI yapıldığında embriyonun arest olması, bu paternal mRNA havuzunun önemini göstermektedir. Nedeni bilinmeyen infertilite olgularında paternal mRNA havuzunun araştırması oldukça büyük önem taşımaktadır. Bu araştırmaların sonuçlarına göre ICSI mediumlarının geliştirilmesi, ICSI ve ART teknolojilerinin geliştirilmesine ve başarı oranlarının yükseltilmesine katkı sağlayabilir. Proje, spermatozoon sitoplazmasındaki mRNA stoğu üzerinde odaklanmaktadır. Zigot gelişiminde önemli rol oynadığı bilinen 5 adet mRNA'nın (TET3, NPM2, CNOT1, CNOT8, XRN1) Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında araştırılmış ve saklama koşullarının (4 veya 15 °C) bu mRNA içerikleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu mRNA'ların fonksiyonları aşağıda özetlenmiştir. NPM2: paternal kromatinin yeniden modellenmesi (protamin-histon değişimi), TET3: totipotensi kazanımı (DNA demetilasyonu), CNOT1, CNOT8 ve XRN1: mRNA yıkımı. Bu çalışmanın amacı, yukarıda bahsedilen erken embriyonik gelişimine katılan 5 gene ait mRNA'ların Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında tespiti ve farklı saklama koşullarının bunlar üzerine etkisinin belirlenmesidir. Gereç ve Yöntem: Çalışmada kullanılan beş Yeni Zelanda ırkı erkek tavşan her biri 4-5 kg canlı ağırlığa sahiptır. Fertilitesi bilinen tavşanlar rutin bakım-besleme koşullarında (16-28°C sıcaklık ve %55-60 nisbi nem oranı) bireysel kafeslerde barındırılmış, ad libitum su ve arpa pelleti ile beslenmiştir. Tez çalışmasında, erkek tavşanlardan suni vajen ile toplanan sperma örnekleri kullanılmıştır. Hayvanlar, ortamda herhangi bir yapay ışık düzenlemesi yapılmaksızın gün ışığına maruz bırakılmıştır. Deney sonunda hiçbir tavşanlar öldürülmemiştir. Spermatolojik xi muayeneler, Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı laboratuvarında gerçekleştirilmıştır. 1. Spermanın alınması ve ön muayenesi Suni vajen yardımıyla alınan spermaların mikroskobik kontrollerinde kitle hareketi 3 ve üstü (0-5 arası skalada), motilitesi %70 ve üstü, anormal spermatozoon oranları ise %20'nin altında olan ve yoğunluğu 250x106 spermatozoa/ml olmalarına özen gösterilmiştir. Tavşanlar arasındaki bireysel farklılıkları yok edebilmek amacıyla yukarıdaki koşullarını sağlayan ejakulatlar 37°C su banyosunda birleştirilip pool edilerek kullanılmıştır. 2. Spermanın Sulandırılması ve Deneysel Grupların Oluşturulması Birleştirilmiş ejekülatlar iki eşit kısma ayrıldı ve önceden 37°C dereceye ısıtılmış Tris- citric acid-glukoz medyumu kullanılarak spermatozoon yoğunluğunun 50x106/ml olacak şeklinde sulandırıldı. Sulandırma sonrası örnekler 2 kısma ayrılıp ilk bölümü 4°C de ve ikinci bölümü de 15°C de 72 saat süresince saklandı. Taze olarak alınan bir ejekülat da kontrol grubu olarak bu iki gruba eklenip, 3 grup ayrı ayrı olarak %50-75 lik percoll-TCG kolonu üzerine yerleştirildikten sonra, 1200 RPM de 10 dk santrifüj işlemiyle ölü ve yabancı hücrelerin (lipid damlacıkları) ayrılmaları sağlandı. Tüplerdeki supernatant uzaklaştırılıp tabanda kalan sperm pelleti 2ml TCG solüsyonu içinde sulandırıldı. 3. mRNA izolasyonu TCG solüsyonundaki sperm örneklerinden total RNA izolasyonu Trizol ile gerçekleştirildi, RNA örnekleri -80 ̊C'de derin dondurucuda saklandı. 4. RT-PCR çalışmaları -cDNA sentezi cDNA sentez kiti kullanılarak cDNA sentezi Applied Biosystems thermal cycler'da gerçekleştirilmiştir. -qRT-PCR qRT-PCR reaksiyonları SYBR Green PCR Master Mix ve TET3, NPM2, CNOT1, CNOT8, XRN1 primerleri kullanılarak Analizler Applied Biosystems Step One RT-PCR Sistemi ile gerçekleştirilmiş, kontrol gen olarak GAPDH kullanılmıştır. xii Normalizasyon işleminde örnekler arasında ilgili genin ifadesinin karşılaştırılma amacıyla ΔCT metodu kullanılmıştır. Karşılaştırmalı ifade seviyesi, 2-ΔΔCT formülü kullanılarak hesaplanmıştır. 5. İstatistiksel Analizler Gruplarda veriler mean±SEM olarak sunulmuş olup grupların parametreler yönünden karşılaştırılma maksadıyla T testi kullanılmıştır. Bulgular: Araştırma sonucuna göre, yukarıda belirtilen beş gen transkriptleri Oryctolagus cuniculus sperm sitoplazmasında tespit edilmiş olup onlardan miktar olarak en çok CNOT8 ve CNOT1, en az ise XRN1 ve NPM2 gen transkriptleri bulunmuştur. Ayrıca, araştırmada TET3 transkriptlerinin saklama sıcaklığına duyarlı olup 15°C'de saklanan grupta 4°C'de saklanan gruba göre daha yüksek miktarda tespit edilmiş ve gruplararası bu farkın istatistiksel olarak anlamlı (P
Özet (Çeviri)
Aims: The current study aims to investigate five mRNA necessary for chromatin decompaction and demetilation and mRNA degradation in Oryctolagus cuniculus sperm cytoplasm. The investigation was implemented on three groups, one fresh control and two stored at different temperatures such as 4°C and 15°C to investigate also an impact of storage temperature on possible mRNA self decay. The results would be beneficial for understanding of maternal – paternal genes interplay during the very first hours of the embryonic development and the impact of paternal genes on the basic tasks implementation just before the embryonic genome activation (EGA). This knowledge would help to improve ART success rates by development better medium, storage and ICSI techniques for the cases with unexplained infertility. Materials and Methods: Sperm for the current project was collected once or twice a week (during 7 weeks) using artificial vagina from adult male rabbits known to be fertile. After dilution, the samples were divided into two equal groups. The first group of the samples was stored at 4°C and the second one was stored at 15°C for 72 hours. At the end of this period, a freshly taken ejaculate after examinations was also added as a control group (without previous storage). The mRNA was isolated, cDNA synthesized and qRT-PCR performed. For the gene expression comparison among the groups the ΔCT method was used as a normalization method, and the Independent Samples one-sided T Test was used to decide on the significance of the intergroups differences with the 0.05 level of significance. Statistic analyses were performed using SPSS (Statistical Packag for Social Sciences) for Windows 22. xiv Results: The study has confirmed that sperm cytoplasm indeed contains paternally produced mRNA, and this study could determine five gene transcripts in Oryctolagus Cuniculus sperm cytoplasm: CNOT1, CNOT8, TET3, NPM2 and XRN1. Moreover, CNOT8 and CNOT1 were present the most, XRN1 and NPM2 were present the least. According to the Independent Samples T Test, TET3 transcripts' sensitive to low storage temperatures was claimed with 87% of statistical power at 0.95 significance. Conclusion: The current study has met it's research goals succesfully. It has added valuable research data to the field of research in sperm cytoplasmic content and to the whole field of embryology. This research contribution has also added to the field of knowledge on Oryctolagus cuniculus species.
Benzer Tezler
- İnfertil erkeklerde paternal kalıtımla ilişkili endog geninin analizi
Analysis of the endog gene associated with paternal inheritance in infertile men
MEHMET ULAŞ BİLİR
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
Genetikİstanbul ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TUBA GÜNEL
- Endometriozise bağlı infertilite nedeni ile yardımla üreme yöntemi kullanılarak elde edilen gebeliklerde farklı endometriozis fenotiplerine göre prognostik faktörler ve erken gebelik sonuçlarının retrospektif analizi
Retrospective analysis of prognostic factors for assisted reproductive technology in women with different endometriosis phenotypes and early pregnancy outcomes
ELİF KÜLAHÇI ASLAN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Kadın Hastalıkları ve DoğumUludağ ÜniversitesiKadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GÜRKAN UNCU
- Açıklanamayan infertilite hasta grubunda yaşanan IVF uygulama başarısızlıklarında sperm DNA hasarı ve anöploidinin etkisi
Effect of sperm DNA damage and aneuploidy in patients with unexplained infertility and previous unsuccessful IVF attempt
ÜMMÜ GÜLSÜM ERCAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
GenetikTurgut Özal ÜniversitesiGenetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. MURAT ÖZNUR
- Varikoselin sperm morfolojisi ve DNA matüritesi üzerine etkileri
The effect of varicocele on sperm morphology and DNA maturity
ALİ ERSİN ZÜMRÜTBAŞ
