Geri Dön

CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı kullanarak TGFBI geninde R124H mutasyonu oluşturmaya yönelik gRNA ve donör DNA tasarlama ve dh5α vektörüne klonlama

Design of donor DNA sequences with gRNA for creating the R124H mutation in the TGFBI gene and creation of CRISPR/Cas9 structures

PDF İndir

  1. Tez No: 756464
  2. Yazar: BÜŞRA KALDIRIM
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. HİLAL ARIKOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Selçuk Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 99

Özet

TGFBI (tranforme edici büyüme faktörü beta ile indüklenen) proteini, kornea dahil pek çok dokuda ifade olan matriks proteinidir. Özellikle korneada hücre dışı matriksin major bileşeni olarak bulunan TGFBI, farklı tip kollajenler ve integrinlerle etkileşime girerek yapısal bütünlüğün ve kornea şeffaflığının korunmasında önemli rol oynamaktadır. TGFBI proteinini kodlayan TGFBI geninde meydana gelen mutasyonlar, korneada anormal TGFBI katlanması ve kümelenmesi ile seyreden, ciddi görme bozukluğu ve kaybına neden olan farklı tipte granüler kornea distrofi (GCD)'lerine yol açmaktadır. Korneal stromada birden fazla ayrı ve düzensiz şekilli granüler opasitelerin biriktiği otozomal dominant veya resesif kalıtılan GCD formları bilinmektedir. Primer kornea hücrelerinin eldesinde ve kültürüzasyonundaki güçlükler nedeniyle kornea epitel hücrelerinin kimliklendirilmesi, biyolojisi, hücresel mekanizmaları ve bunların hastalık patogenezindeki rolleri anlaşılamamakta ve etkin ilaç deneme çalışmaları yapılamamaktadır. Bu nedenle, en yaygın görülen GCD formlarından biri olan GCD Tip 2 (GCD2) kornea distrofisinin, CRISPR/Cas9 (düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri/CRISPR-ilişkili nükleaz-9) genom düzenleme teknolojisi kullanılarak, hücresel düzeyde modellenebilmesi amaçlandı. Bu çalışmada hücresel düzeyde GCD2 hastalığının modellenebilmesi için gerekli klonlama ve doğrulama adımlarının yapılması hedeflendi. Bunun için GCD2 kornea distrofisine neden olduğu bilinen TGFBI genindeki Arg124His (R124H) mutasyonunu oluşturmaya yönelik single guide RNA (sgRNA) ve donör DNA tasarlandı. https://www.benchling.com/ online software programı kullanılarak tasarlanan ve ticari olarak temin edilen gRNA'lar plazmit vektörüne (79145, Addgene) klonlandı. Klonlama aşamasının ardından bir E.coli varyantı olan DH5alpha bakterisine transformasyon yapıldı. Transformasyon sonrası, koloni PZR ve dizi analizi gerçekleştirildi. Dizi analizi sonuçlarına göre gRNA'ların başarıyla klonlandığı gösterildi. Böylece ökaryotik hücreye transfeksiyon için hazır CRISPR/Cas9 vektörler elde edildi. Hücresel ve moleküler mekanizmaları hala tam olarak bilinmeyen ve kesin tedavisi olmayan bu hastalığın modellenmesi hastalığın temel mekanizmasının daha detaylı anlaşılması ve hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının geliştirilebilmesine önemli katkılar sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

TGFBI (transforming growth factor beta-induced) protein is a matrix protein that is expressed in many tissues, including the cornea. TGFBIp, which is a major component of the extracellular matrix especially in the cornea, plays an important role in maintaining the structural integrity and transparency of the cornea by interacting with different types of collagens and integrins. Mutations in the TGFBI gene which encodes the TGFBI protein, lead to different types of granular corneal dystrophy (GCD), characterized by abnormal folding and accumulation of TGFBIp in the cornea, causing severe visual impairment and loss. Autosomal dominant or recessive forms of GCD in which more than one discrete and irregularly shaped granular opacities accumulate in the corneal stroma, are known. Due to the difficulties of obtaining and culturing primary corneal cells, identification of corneal epithelial cells, their biology, cellular mechanisms and roles in the pathogenesis of the disease cannot be understood, and effective drug trials cannot be performed. Therefore, in our study, it was aimed to model GCD Type 2 (GCD2) corneal dystrophy, one of the most common forms of GCD, at cellular level using CRISPR/Cas9 genome editing technology targeting to perform the necessary cloning and validation steps for modeling. Guide RNA (gRNA) and donor DNA were designed to generate the Arg124His (R124H) mutation in the TGFBI gene, which is known to cause GCD2 corneal dystrophy. gRNAs, designed using the https://www.benchling.com/ online software program and obtained commercially, were cloned into the plasmid vector (79145, Addgene). Following the cloning step, vectors were transformed into DH5alpha bacteria, an E.coli variant. After transformation, colony PCR and sequence analysis were performed. Successfully cloned gRNAs were confirmed according to the results of the sequence analysis. By this way, CRISPR/CAS9 construct vectors ready for transfection into eukaryotic cell have been created. Modeling of this disease, which cellular and molecular mechanisms are still unknown and has not a definite treatment, will make important contributions to a more detailed understanding of the basic mechanism of the disease and the development of targeted treatment approaches.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    951341

    Makine öğrenmesi modelleri kullanarak CRISPR-Cas9 tabanlı gen düzenleme sistemlerinin optimizasyonu

    Optimization of CRISPR-Cas9 based genome editing systems using machine learning models

    ALPEREN TOKGÖZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyomühendislikFırat Üniversitesi

    Yazılım Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ÖZAL YILDIRIM

  2. Tez No

    663481

    CRISPR/cas9 sistemi ile bcr/abl gen füzyonunun in vitro kalitatif analizi

    In vitro qualitative analysis of BCR/ABL gene fusion with crispr/CAS9 system

    FEHİME DENİZ KANAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    GenetikBaşkent Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YUNUS KASIM TERZİ

  3. Tez No

    888636

    Investigation of the effects of abrb and cody deletions on the bacilysin overproducer B. subtilis HWA strain

    AbrB ve CodY yokluğunun basilisin yüksek üreticisi B. subtilis HWA suşundaki etkilerinin incelenmesi

    GÖKSU TARTAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  4. Tez No

    956585

    Tütün bitkisinde lignin modifikasyonu için comt geninin CRISPR/CAS9 yöntemi kullanılarak susturulması

    The silencing of comt gene for lignin modification in tobacco plant using CRISPR/CAS9 method

    BARIŞ GÜL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyolojiYıldız Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEVGİ MARAKLI

    DR. MERVE YILMAZER

  5. Tez No

    934409

    Development of methods and tools in ipscs and zebrafish towards modeling of dna sequence variants in patients with pachygyria by using genome editing technologies that will lead to personalized medicine applications

    Pakigrili hastalarda görülen dna dizi variantlarının iPSC'lerde ve zebrabalığında genom düzenleme araçları ile modellenerek kişiye yönelik tıp uygulamalarına olanak tanıyacak yöntem ve platformların geliştirilmesi

    AYKUT KURUOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    GenetikDokuz Eylül Üniversitesi

    Genom Bilimleri ve Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ YAVUZ OKTAY

Geri Dön