Geri Dön

CRISPR/Cas9 genom düzenleme aracı kullanarak TGFBI geninde R124H mutasyonu oluşturmaya yönelik gRNA ve donör DNA tasarlama ve dh5α vektörüne klonlama

Design of donor DNA sequences with gRNA for creating the R124H mutation in the TGFBI gene and creation of CRISPR/Cas9 structures

PDF İndir

  1. Tez No: 756464
  2. Yazar: BÜŞRA KALDIRIM
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. HİLAL ARIKOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Selçuk Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 99

Özet

TGFBI (tranforme edici büyüme faktörü beta ile indüklenen) proteini, kornea dahil pek çok dokuda ifade olan matriks proteinidir. Özellikle korneada hücre dışı matriksin major bileşeni olarak bulunan TGFBI, farklı tip kollajenler ve integrinlerle etkileşime girerek yapısal bütünlüğün ve kornea şeffaflığının korunmasında önemli rol oynamaktadır. TGFBI proteinini kodlayan TGFBI geninde meydana gelen mutasyonlar, korneada anormal TGFBI katlanması ve kümelenmesi ile seyreden, ciddi görme bozukluğu ve kaybına neden olan farklı tipte granüler kornea distrofi (GCD)'lerine yol açmaktadır. Korneal stromada birden fazla ayrı ve düzensiz şekilli granüler opasitelerin biriktiği otozomal dominant veya resesif kalıtılan GCD formları bilinmektedir. Primer kornea hücrelerinin eldesinde ve kültürüzasyonundaki güçlükler nedeniyle kornea epitel hücrelerinin kimliklendirilmesi, biyolojisi, hücresel mekanizmaları ve bunların hastalık patogenezindeki rolleri anlaşılamamakta ve etkin ilaç deneme çalışmaları yapılamamaktadır. Bu nedenle, en yaygın görülen GCD formlarından biri olan GCD Tip 2 (GCD2) kornea distrofisinin, CRISPR/Cas9 (düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri/CRISPR-ilişkili nükleaz-9) genom düzenleme teknolojisi kullanılarak, hücresel düzeyde modellenebilmesi amaçlandı. Bu çalışmada hücresel düzeyde GCD2 hastalığının modellenebilmesi için gerekli klonlama ve doğrulama adımlarının yapılması hedeflendi. Bunun için GCD2 kornea distrofisine neden olduğu bilinen TGFBI genindeki Arg124His (R124H) mutasyonunu oluşturmaya yönelik single guide RNA (sgRNA) ve donör DNA tasarlandı. https://www.benchling.com/ online software programı kullanılarak tasarlanan ve ticari olarak temin edilen gRNA'lar plazmit vektörüne (79145, Addgene) klonlandı. Klonlama aşamasının ardından bir E.coli varyantı olan DH5alpha bakterisine transformasyon yapıldı. Transformasyon sonrası, koloni PZR ve dizi analizi gerçekleştirildi. Dizi analizi sonuçlarına göre gRNA'ların başarıyla klonlandığı gösterildi. Böylece ökaryotik hücreye transfeksiyon için hazır CRISPR/Cas9 vektörler elde edildi. Hücresel ve moleküler mekanizmaları hala tam olarak bilinmeyen ve kesin tedavisi olmayan bu hastalığın modellenmesi hastalığın temel mekanizmasının daha detaylı anlaşılması ve hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının geliştirilebilmesine önemli katkılar sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

TGFBI (transforming growth factor beta-induced) protein is a matrix protein that is expressed in many tissues, including the cornea. TGFBIp, which is a major component of the extracellular matrix especially in the cornea, plays an important role in maintaining the structural integrity and transparency of the cornea by interacting with different types of collagens and integrins. Mutations in the TGFBI gene which encodes the TGFBI protein, lead to different types of granular corneal dystrophy (GCD), characterized by abnormal folding and accumulation of TGFBIp in the cornea, causing severe visual impairment and loss. Autosomal dominant or recessive forms of GCD in which more than one discrete and irregularly shaped granular opacities accumulate in the corneal stroma, are known. Due to the difficulties of obtaining and culturing primary corneal cells, identification of corneal epithelial cells, their biology, cellular mechanisms and roles in the pathogenesis of the disease cannot be understood, and effective drug trials cannot be performed. Therefore, in our study, it was aimed to model GCD Type 2 (GCD2) corneal dystrophy, one of the most common forms of GCD, at cellular level using CRISPR/Cas9 genome editing technology targeting to perform the necessary cloning and validation steps for modeling. Guide RNA (gRNA) and donor DNA were designed to generate the Arg124His (R124H) mutation in the TGFBI gene, which is known to cause GCD2 corneal dystrophy. gRNAs, designed using the https://www.benchling.com/ online software program and obtained commercially, were cloned into the plasmid vector (79145, Addgene). Following the cloning step, vectors were transformed into DH5alpha bacteria, an E.coli variant. After transformation, colony PCR and sequence analysis were performed. Successfully cloned gRNAs were confirmed according to the results of the sequence analysis. By this way, CRISPR/CAS9 construct vectors ready for transfection into eukaryotic cell have been created. Modeling of this disease, which cellular and molecular mechanisms are still unknown and has not a definite treatment, will make important contributions to a more detailed understanding of the basic mechanism of the disease and the development of targeted treatment approaches.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    663481

    CRISPR/cas9 sistemi ile bcr/abl gen füzyonunun in vitro kalitatif analizi

    In vitro qualitative analysis of BCR/ABL gene fusion with crispr/CAS9 system

    FEHİME DENİZ KANAT

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    GenetikBaşkent Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. YUNUS KASIM TERZİ

  2. Tez No

    522360

    Development of gene editing strategies for human β-globin (HBB) gene mutations

    İnsan β-globin (HBB) gen mutasyonları için gen düzenleme stratejilerinin geliştirilmesi

    BATUHAN MERT KALKAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyomühendislikYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. FATİH KOCABAŞ

  3. Tez No

    629372

    Crispr/Cas9 sistemi kullanılarak tütün (Nicotiana tabacum) bitkisinde DEK1 geninin susturulması

    Silencing the DEK1 gene ın tobacco (Nicotiana tabacum) plant using the Crispr/Cas9 system

    AYŞEGÜL ŞENYER

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyoteknolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MUSA KAVAS

  4. Tez No

    494832

    CRISPR-Cas9 sistemini ifade eden transgenik tütün bitkisinin elde edilmesi

    Obtaining the transgenic tobacco plant expressing the CRISPR-Cas9 system

    DURSUNE MERVE KARATAŞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    BiyoteknolojiOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MUSA KAVAS

  5. Tez No

    762057

    The use of CRISPR/DCAS9 engineered mscs to prevent cisplatin-induced cellular damage in human granulosa cells

    Sisplatin ile indüklenen insan granüloza hücrelerinde ki hücre hasarini önlemek için CRİSPR/DCAS9 tasarlanmiş MSC'lerin kullanimi

    MEHMET YUNUS ÇOMAR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı

    DR. SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU

Geri Dön