Engineering CRISPR-based DNA transversion editing technologies
CRISPR-temelli DNA transversiyon editleme teknolojilerinin mühendisliği
- Tez No: 760309
- Danışmanlar: DR. J. KEITH JOUNG
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Genetik, Bioengineering, Biotechnology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Harvard University
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Biyolojik Bilimler Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Halk Sağlığı Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 240
Özet
Adenin Baz Editörleri (ABE) ve Sitozin Baz Editörleri (CBE) sırasıyla A'dan G'ye ve C'den T'ye transisyon mutasyonlarını verimli bir şekilde gerçekleştirebilirler. Lakin, işbu çalışmamız yayınlana kadar, C'den G'ye transversiyon mutasyonlarını insan hücrelerinde yüksek verim ile yükleme yetisine haiz ve programlanabilir bir baz editörü dizayn edilmemişti ve mevcut değildi. Protein mühendisliği metodlarını kullanmak sureti ile mevcut CBE mimarisini modifiye ederek CGBE ismini verdiğimiz C'den G'ye Baz Editörlerini geliştirdik. Optimize ettiğimiz CGBE moleküler araçları, özellikle AT-zengin hedeflerde, ~%70'lere varan verimlere ulaştılar. CGBE editörlerimizin optimal hedef penceresi PAM'in tersi ucundan saymaya başlandığında 5. ila 7. nükleotidler arasıdır. Mamafih, NG ve NGA esnekletilmiş ve genişletilmiş alternatif PAM motiflerini tanıyabilen SpCas9 varyantlarını kullanarak da CGBE editörlerimizin üzerindeki hedef kısıtlamasını nispeten kaldırabildiğimizi gösterdik. CGBE araçlarımızın atası olan BE4max CBE enzimi ile kafa kafaya kıyas ettiğimizde, CGBE araçlarımızın umumiyetle daha müspet bir Cas9-bağımlı DNA ıskalama (off-target) profili çizdiğini müşahade ettik. Son olarak, piyasada mühendisliği gerçekleştirilmiş olan en esnek ve en güçlü gen ve genom editleme teknolojisi olan Prime Editörü (PE) ile kafa kafaya yaptığımız kıyas deneylerimizde CGBE proteinlerimizin dört farklı insan kanser hücre hattında ve dört farklı hedefte PE2 ve PE3 teknolojilerini alt ettiğini ve verim açısından geride bıraktığını gözlemledik. Muhakkak ki, işbu çalışmada tasvir ettiğimiz CRISPR-tabanlı CGBE moleküler araçlarımız baz editörlerinin tatbik kudretini hem Ar-Ge hem de tıbbî tedavisel alanlarda arttıracaktır. Tezin 1. Bab'ı bir girizgahtır ve mühtevasında genom editleme bilim alanının, alan içindeki kayda değer ve ehemmiyetli keşiflerin ve icatların, istenmeyen/menfi ıskalama (off-target) genom editleme mefhumunun, ıskalama tahlilinde kullanılabilecek platform ve metodların kronolojik özetlerini barındırır. Tezin 2. Bab'ı yukarıda zikredilen CGBE protein mühendisliği maceramızın Nature Biyoteknoloji dergisinde basılmış olan makalesini ve teze özel genişletilmiş ve kapsamlı tartışma ve sonuç kısımlarını ihtiva eder. Tezin 3. Bab'ı doktora çalışmalarımız sırasında başladığımız, deneyler sonucunda heyecan verici sonuçlar elde ettiğimiz, lakin tamamlamaya kâdir olamadığımız ve GBE ismini verdiğimiz CRISPR-esaslı Guanin Baz Editörleri protein mühendisliği maceramızı anlatmaktadır. Tezin 4. Bab'ı CRISPR ıskalama oranlarını (off-target editing) tespit ve tahlil etmek için kullanılan ve sahadaki altın standard hükmünde kabul gören in vitro ve in vivo metodlarını daha hassas, zaman açısından verimli, ve ölçeklenebilir hale getirmek hedefleri ile Tn5 transposon proteinin kendimiz tarafından imalatını, ve akabinde bu metodlara entegre edilmeye çalışılmasını ihtiva eder. Okuyucumuz, bu babda da heyecan verici deney sonuçlarını müşahade edecektir. Bu bab, aynı zamanda, 5000 adet sentetik DNA ıskalama hedef tahtasını insan hücrelerine ve DNAsına virüsler aracılığı ile entegre edişimizi, ve bu platformu CRISPR-esaslı genom editleme araçlarının tutarlılığını ve ıskalama oranlarını yüksek-çıktı kuvveti ile tespit edişimizi de içerir. Tezin 5. Bab'ı ise bilumum önceki bablarda zikredilen Ar-Ge gayretlerimizin genom editleme bilim sahasına katkılarını ve genel olarak genom editleme alanının CRISPR özelinde istikbalini bilimsel ve şahsî fikirlerimiz ışığında ele alır.
Özet (Çeviri)
Adenine base editors (ABE) and cytosine base editors (CBE) can efficiently install A-to-G and C-to-T transition edits, respectively. However, until recently, the field lacked base editors to efficiently install C-to-G transversion edits in human cells in a programmable manner. We modified the existing CBE architectures to repurpose them into new C-to-G base editors (CGBEs). Our optimized CGBE induced C-to-G alterations with efficiencies as high as ~70%, particularly in AT- rich sequence contexts. CGBE exhibited a narrow editing window within the target site (positions 5-7 in the SpCas9 spacer sequence) but we also showed that incorporation of SpCas9 PAM recognition variants that can recognize NG or NGA PAMs into CGBE are functional, thereby expanding the range of targetable sites. CGBE displayed favorable Cas9-dependent DNA off-target profiles compared to the BE4max C-to-T base editor. We found in side-by-side comparison that CGBE achieves higher efficiencies of C-to-G edits compared with the recently described PE2 and PE3 prime editing technologies across different cell lines. CGBE described here expands the editing capabilities of the base editor platform for both research and therapeutic applications. Chapter 1 lays the foundational introduction into the field of genome editing, prominent tools engineered in chronological order, off-target genome editing, and platforms and methods to assess specificity profiles of genome editing tools. Chapter 2 describes the novel CRISPR-based C-to-G Base Editors (CGBE) that can efficiently install C-to-G transversion edits in human cells in context-dependent manner. Chapter 3 describes the efforts and attempt towards engineering novel CRISPR-based Guanine Base Editors (GBE) that can introduce G-to-T transversion mutations. Chapter 4 describes the efforts to integrate Tn5-based transposition system into the current frameworks of the gold standard in vitro and in vivo off-target methods to increase their scalability, sensitivity, and time-efficiency. Finally, this chapter describes a synthetic self-targeting in cellular off-target library that can be used to score precision or fidelity of CRISPR-based genome editing tools in a high-throughput manner. Chapter 5 discusses the big picture and future of the genome editing field, bigger research relationships, and our contribution to the current field with the work outlined in this thesis.
Benzer Tezler
- Establishment of Cas9 endonuclease technology in rye
Çavdarda Cas9 endonükleaz teknolojisinin kullanilmasi
MUHAMMAD ARSLAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
ZiraatEge ÜniversitesiTohumluk Bilimi ve Teknolojisi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EVREN KOBAN BAŞTANLAR
DR. SAMEH SELİM
- Comparison of screening methods for CRISPR/CAS9-inducedmutations
CRISPR/CAS9-indüklenmiş mutasyonlar için görüntüleme yöntemlerinin karşılaştırılması
ASENA CANTÜRK
Yüksek Lisans
İngilizce
2019
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NURİ ÖZTÜRK
- Engineering of probiotic Saccharomyces boulardii as a host for living therapeutic applications
Probiyotik Saccharomyces boulardii'nin yaşayan terapötik uygulamalarında konak olarak kullanılmak üzere geliştirilmesi
ORHAN NEDİM KURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER
- E. coli'de shigatoksin üretiminden sorumlu STX genlerinin ve CRISPR dizilerinin analizi
Analysis of CRISPR sequences and STX genes responsible for shigatoxin production in E. coli
DOĞUKAN GÜL
- REPAIRv1 [dPspCas13b-ADAR2DD (E488Q)] ile memeli hücrelerinde gen çeşitlendirilmesi
Gene diversification in mammalian cells with REPAIRv1 [dPspCas13b-ADAR2DD (E488Q)]
MUSTAFA ÖZKAN
