PCR based, isolation, cloning on expression of streptokinase gene from a group c streptococcus equisimilis in e.coli
Bir grup c (Streptocossus equisimilis)'e ait olan streptokinaz genin pcr-aracılığı ile izolasyonu, klonlaması ve e.coli'de ifade edilmesi
- Tez No: 76075
- Danışmanlar: PROF. DR. UFUK GÜNDÜZ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1998
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 161
Özet
Patojenik P-hemolitic streptococci grupları tarafından A, C ve G doğal olarak salgılanan ve bir plasminojen aktivatorü olan streptokinaz (SK), 30 yıldan beri bir klinik trombolitik ajanı olarak geniş bir şekilde kullanılmaktadır. SK'nin normal üretimindeki verim düşüklüğü ve konaktaki patogenisitesi, SK'nin bir rekombinant kaynağının araştırılmasının başlıca nedenidir. Bu tezde PCR metodu kullanılarak genomik templeytinin (template) hazırlanması için yeni bir yaklaşım getirilerek streptokinaz genin (skc) yüksek düzeyde spesifik ve çoğaltılmış parçasının izolasyonu açıklanmıştır. Bu yaklaşım, başlıca dış Pst I bölgelerin skc'nin komşu bölgelerinde (flanking regions) korunmasına dayanmaktadır. Tezde ayrıca, uygulanabilir geniş ifade edilme sistemlerinelde edilmesinde SK genlerin artırılması için 3 primer çiftinin uygulanması açıklanmıştır. Daha sonra vektördeki PCR ürünlerinin klonlanması, kompetent E. coli hücrelerinin transformasyonu, izolasyonu ve sınırlanmış harita analizi ve her iki DNA zincirinin dizilmesi ile uygun yapıların hazırlanması ve çalışmada E. coli'de skc'nin klonlanmasında karşılaşılan zorluklara değinilmiştir. Çalışmada daha sonra uygun konaklarda aktif rekombinant SK senteziyle sonuçlanan iki tip ifade edilme sisteminin yapısı açıklanmıştır. Bu sistemlerden birincisi lac Z'ye göre skc'nin pUC18 inframe içerisinde yerleştirilmiş bir açık okuma frame (open reading frame) vektörüdür. Böylece IPTG'nin indüklenmesi sonucu SK-pozitif fenotip gösteren, birleşik proteini elde edilmektedir. İkinci tip rekombinant ifade edilme vektörü, ısı indüklemesi sonucu E. coli'deki SK üretimini yönlendiren ve bakteriyofaj APr promoter ve Shine-Dalgarno dizilerinin (sequences) kontrolünde s&c'nin yerleştirilmesiyle ortaya çıkan yapıdan oluşmaktadır. Sonuçta ürünlerin özellikleri, arena düzeyinde Northern Dot Blotting ve protein düzeyinde SDS-PAGE, Western Blot ve kazein/plasminojen yöntemleriyle açıklanmaktadır. Bu çalışmada ısı aracığıyla ifade sistemlerinin düşük maliyetli ve güvenilir rekombinant sk'ların üretiminde başarıyla kullanılabileceği ve buna ilavaten SK proteinin NH2 terminal bölgesi değiştirilse bile hala aktif protein elde edilebileceği varsayımı doğrulanmaktadır. Ayrıca, skc'nin pUC19'da yerleştirilmesiyle ilginç bir alfa- komplimantasyon oluşması sonucu, skc'nin anti-N-terminal bölgesinde translasyon başlangıç bölgesini belirledik.
Özet (Çeviri)
Streptokinase (SK), a plasminogen activator which is naturally secreted by pathogenic, p-hemolytic groups A, C and G streptococci, is widely used clinically as a thromblytic agent for almost three decades. The low yield obtained in normal SK production and the pathogenicity of its host are the principal reasons to search for a recombinant source of SK. In this thesis, a new approach for prepartion of genomic template will be described to isolate the streptokinase gene (skc) as an extremly specific amplified fragment via PCR method. This approach is principally based on theconservation of the external Pst I sites in the flanking region of skc. The thesis will also describe, application of three pair of primers for amplification of SK gene, providing a broad range of expression systems applicable. Subsequently, cloning of the PCR products in the vectors, transformation of competent E.coli cells, isolation and preparation of the proper constructs by restriction map analysis, sequencing of both DNA strands and results of our study about difficulties encountered in cloning of skc in E.coli will be discussed. This study will then explain construction of two types of expression systems, which in appropriate hosts, results in synthesis of active recombinant SK (r-SK). The first is an open reading frame (ORF) vector in which skc is inserted into pUC18 inframe with respect to lac Z\ thus providing a fusion protein (Lac- SK) that confers a SK-positive phenotype as a result of induction by IPTG. The second type of recombinant expression vector is constructed by placing the SK gene under the control of bacteriophage XPr promoter and Shine-Dalgarno sequences in tandem, which directs production of SK in E.coli upon heat induction. Finally, characterization of the products at the RNA level by Northern Dot Blotting and at the protein level by SDS- PAGE, Western Blot and casein/plasminogen assay will be presented. This study ultimately concludes that heat-mediated expression systems may successfully be applied for the production of authentic lower price r-SK and further confirms the previous suggestions that active SK is obtained despite modifications in the NH2-terminal. In addition, we describe detection of a translation initiation region in the anti-N-terminal region of skc as a result of an interesting ct-complementation by insertion of skc in pUC19.
Benzer Tezler
- Aspergillus flavus karbonik anhidraz geninin klonlanması ve E. coli'de ekspresyonu
Cloning and expression of Aspergillus flavus carbonic anhydrase gene
ZARİF ECE CEYLAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyolojiBalıkesir ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TÜLİN AŞKUN
YRD. DOÇ. DR. HATİCE YILDIRIM
- Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve analizi
Isolation, cloning and analysis of the gene encoding lactate dehydrogenase enzyme from Fusobacterium nucleatum
EMRAH SARIYER
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. DİLEK BALIK
- Leishmania infantum aşı adayı LACK ve KMP-11 genlerinin moleküler karakterizasyonu, füzyon proteinin ekspresyonu ve antijenik yapısı
Molecular characterization of leishmania infantum LACK and KMP-11 vaccine candidate genes, expression and antigenic structure of fusion protein
SERKAN KARACA
Doktora
Türkçe
2018
ParazitolojiErciyes ÜniversitesiTıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALPARSLAN YILDIRIM
- Laboratuvar hattı Lucilia sericata'nın lucimycin, chymotrypsin, lucifensin genlerinin moleküler karakterizasyonu ve rekombinant füzyon proteinin ekspresyon denemeleri
Molecular characterization of lucimycin, chymotrypsin, lucifensin genes of Lucilia sericata lab line and expression trials of recombinant fusion protein
EMRAH ERDOĞAN
Doktora
Türkçe
2020
ParazitolojiErciyes ÜniversitesiTıbbi Parazitoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
- Kızılçam (Pinus brutia Ten.) sitokrom P450720B (CYP720b) geninin klonlanması ve karakterize edilmesi
Cloning and characterization of cytochrome P450720B (CYP720B) from Turkish red pine (Pinus brutia Ten.)
ASLI SEMİZ