Geri Dön

PID-PC'lerden izole edilen eksozomların pankreas kanseri üzeine etkisi

Effects of exosomes isolated from PID-PCs on pankreatic cancer

PDF İndir

  1. Tez No: 766154
  2. Yazar: İMREN HASOĞLU
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYŞE KARATUĞ KAÇAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: İstanbul Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 110

Özet

Pankreas ekzokrin ve endokrin salgı yapan iki kısımdan oluşur. Ekzokrin pankreas asinar ve kanal hücrelerinden oluşurken, endokrin pankreas beş farklı hücre tipine sahip Langerhans adacıklarından oluşur. Pankreas kanseri en ölümcül malign neoplazmalardan biridir ve kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Yıllık sağ kalım oranı %5'ten az olan pankreas kanserin de semptomların ileri evrede ortaya çıkmasından ve ayırt edici olmamasından dolayı tanısında geç kalınmaktadır. Kök hücreler kendi kendini yenileme, klonalite ve farklılaşma yeteneğine sahip embriyonik ve fetal dönemlerinde doku ve organların oluşumunda rol oynayan, yetişkin dönemlerinde ise hasar onarımda etkili olan farklılaşmamış hücrelerdir. Yetişkin dönem kök hücrelerinden biri olan mezenkimal kök hücreler antiinflamatuar, immünoregülatör ve immünosupresif kapasiteye sahiptirler. Pankreatik ada türevli progenitör hücreler (PID-PC) ise tipik bir mezankimal kök hücre özelliğine sahiptir. Eksozomlar 50-150 nm çapında, lipit çift katman ile kaplı veziküllerdir. Hücreler arası etkileşimde etkili olan bu vezikülleri diğer veziküllerden ayıran ve onları önemli kılan taşıdıkları RNA kargolarıdır. Salgılandıkları hücrelerden miRNA ve mRNA taşıyarak hedef hücrede değişikliğe sebep olabilmeleri, kanser dahil birçok farklı hastalığın tanı ve tedavisinde eksozomların rol alabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızın amacı PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre soylarından izole edilen eksozomları karakterize etmek ve ilk defa karşılaştırılmalı olarak boyut analizi yapmaktır. Ayrıca, çalışmanın ikinci amacı olarak, ilk defa PID-PC'lerden izole ettiğimiz eksozomların insülinoma beta hücre tümörü olan INS-1 ve pankreas kanseri olan MiaPaca-2 hücre soyları üzerindeki etkisini araştırmaktır. PID-PC'LERDEN İZOLE EDİLEN EKSOZOMLARIN PANKREAS KANSERİ ÜZERİNE ETKİSİ xvi Eksozomlar her üç hücre soyundan eksozom izolasyon kitleri ile izole edilmiştir. Hem izole edilen eksozomlar da hem de her üç hücre soyundan elde edilen lizatlarda eksozom belirteci olarak bilinen Alix, TSG101, CD9 ve CD81 proteinleri Simple Wes ile analiz edilmiştir. Üç farklı hücre soyundan elde edilen eksozomların boyutları ve konsantrasyonları Nano Partikül İzleme Analizi (NTA) ile belirlenmiştir. Karakterize edilen PID-PC'lerden izole edilen eksozomlar 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 ve 10 µg/ml konsantrasyonlarda hem INS-1 hem de MiaPaCa-2 hücre soylarına 24 ve 72 saat uygulandıktan sonra hücre canlılık testi (MTT) yapılmıştır ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Belirlenen IC50 değerlerindeki eksozomlar INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarına 72 saat uygulandıktan sonra hücreler fikse edilip immünohistokimyasal olarak HSP90, HSF-1, Nestin, Endoglin, Kaspaz-8, Aktif Kaspaz-3, Beclin ve p-Bcl-2 antikorları ile işaretlenmiştir. Işık mikroskobunda bilgisayar destekli görüntü analiz programı NIS-Element D 3.1 programı kullanılarak proteinlerin işaretlenme yoğunlukları hesaplanmıştır. Belirlenen IC50 değerindeki eksozomlar MiaPaca-2 hücre soyuna 72 saat uygulandıktan sonra LDH kiti ile hücre sitotoksisitesi ölçülmüştür. Ayrıca eksozomun INS-1 hücre soyunda fonksiyonel olarak etkisini araştırmak için belirlenen IC50 değerindeki eksozomlar 72 saat INS-1 hücrelerine uygulandıktan sonra hücre sekresyonu toplanmış ve hücre lizatı elde edilmiştir. Elde edilen hücre lizatında ve sekresyonunda İnsülin ELİSA kiti ile insülin seviyelerine bakılmıştır. Simple Wes analizlerine göre PID-PC, Miapaca-2 ve INS-1 hücre soylarından izole edilen eksozomlarda, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında Alix proteini tespit edilmiştir. TSG101 proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında bulunurken, izole edilen eksozomlarında görülmemiştir. CD9 proteini PID-PC, MiaPaca-2 ve INS-1 hücre lizatlarında ve INS-1 hücre soyundan elde edilen eksozomlarda gözlemlenmiştir. CD81 proteini ise sadece MiaPaca-2 hücre soyundan elde edilen lizatta çok az miktarda görülmüştür. NTA sonuçlarına göre PID-PC'lerden izole edilen eksozomların 103.6 ± 28.6 nm, MiaPaca-2 hücre soyundan izole edilen eksozomların 100.7 ± 10 nm, INS-1 hücre soyundan izole edilen eksozomların 147.2 ± 12.3 nm olarak boyutları analiz edildi. Hücre canlılık analizine göre, PID-PC'lerden izole edilen eksozomlar ile MiaPaca-2 hücreleri 24 saat inkübe edilmesi sonucu düşük konsantrasyonlardaki eksozom uygulaması sonucu hücre canlılığında anlamlı bir değişiklik olmamaktadır. MiaPaca-2 hücrelerinin 72 saat izole edilen eksozomlar ile inkübasyonu sonucu düşük dozlardan itibaren hücre canlılığında anlamlı bir azalma meydana gelmektedir. INS-1 hücre soyunun ise eksozom ile 24 saat inkübe edilmesi sonucu 5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar hücre canlılığında kontrole kıyasla farklılık görülmemiştir. INS-1 hücrelerinin eksozomlar ile 72 saat inkübe edilmesi sonucunda 2,5 µg/ml konsantrasyonda eksozom uygulamasına kadar değişiklik gözlenmezken, ileri dozlarda eksozom uygulaması sonucu hücre canlılığı anlamlı bir şekilde azalmaya başlamıştır. İmmünohistokimyasal işaretlenme sonuçlarına göre, INS-1 hücre soyuna eksozom uygulandığında HSP90 immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlılık göstermezken, eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda HSP90'nın immünboyama yoğunluğu kontrol grubuna göre anlamlı derecede artmıştır. Ayrıca her iki hücre soyunun da eksozom uygulanan gruplarında MiaPaca-2 hücre soyunun HSP90 immünboyama yoğunluğu INS-1 hücre soyuna göre anlamlı derecede yüksektir. HSF-1 immünboyama yoğunluğunda eksozom uygulanan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarında kendi kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlılık yokken, MiaPaca-2 hücre soyunun kontrol grubunun INS-1 hücre soyunun kontrol grubuna göre ve eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre xvii soyunun eksozom uygulanan INS-1 hücre soyuna göre HSF-1 immünboyama yoğunlukları anlamlı derecede fazladır. Eksozom uygulanan ve uygulanmayan INS-1 ve MiaPaca-2 hücre soylarında Nestin ve Endoglin immünboyama yoğunluğunda anlamlı bir farklılık yoktur. Nestin'in immünboyanması sonucunda, her iki hücre soyunun kontrol grubunda Nestin proteinine ait hiç işaretlenme yoktur. Benzer bir şekilde Endoglin'in immünboyanması sonucunda, INS-1 hücre soyunun hem kontrol grubunda hem de eksozom uygulanan grubunda, MiaPaca-2 hücre soyunda ise sadece kontrol grubunda Endoglin proteinine ait hiç işaretlenme olmamıştır. Miapaca-2 hücre soyunda Kaspaz-8 ve Aktif Kaspaz-3 immünboyama yoğunluklarında eksozom uygulanan grupta kontrol gruba göre farklılık görülmemiştir. Beclin ve p-Bcl-2 immünboyama yoğunluklarında eksozom uygulanan MiaPaca-2 hücre soyunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalma vardır. MiaPaca-2 hücre soyuna eksozom uygulaması sonrasında MiaPaca-2 hücre soyundan salınan LDH seviyesi %13,98 ± 3,361 olarak analiz edilmiş ve hücre sitotoksititesi belirlenmiştir. Eksozom uygulanan INS-1 hücrelerine ait hücre sekresyonu ve lizatında ELİSA kiti ile ölçülen insülin seviyelerine göre hücre lizatlarında insülin seviyesi kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. Ancak hücre sekresyonunda insülin seviyesi kontrol gruba göre farklılık göstermemiştir. Ayrıca eksozom uygulanan INS-1 hücre lizatlarında insülin seviyesi hücre sekresyonuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir derecede artış göstermiştir. Sonuç olarak, PID-PC, MiPaca-2 ve INS-1 hücre soylarından ilk defa tarafımızca izole edilen ve boyut analizi gerçekleştirilen eksozomların literatürde yer alan farklı kaynaklardan izole edilen eksozom boyutlarına göre benzer olduğunu gördük. Alix proteininin üç hücre soyundan izole edilen eksozomlar için ve CD9 proteininin sadece INS-1'den izole edilen eksozomlar için spesifik bir belirteç olabileceğini gözlemledik. PID-PC soyundan izole edilen eksozomların MiaPaca-2 hücrelerini zamana ve doza bağlı olarak hücre ölümüne götürdüğünü hücre canlılık analizinde tespit ettik. Bunun yanı sıra MiaPaca-2 hücreleri için belirlenen IC50 değerinin pankreatik beta hücrelerini en iyi şekilde taklit eden ve bazı çalışmalarda sağlıklı pankreatik beta hücreleri yerine de kullanılabilen INS-1 hücrelerinde hücre canlılığı üzerine etkili olmaması, izole edilen eksozomların sağlıklı hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürebileceğini düşündürmektedir. İmmünboyama sonucunda MiaPaca-2 hücre soyunda HSP90'nın anlamlı bir şekilde artışı, pankreas kanserinde olası eksozom ile tedavi durumunda bu proteinin artışının bir belirteç olabileceğini düşündürmektedir. p-Bcl-2 seviyesinin MiaPaca2 hücre soyunda anlamlı azalışı hücrelerin apoptotik yolla ölebileceğini gösterirken, Aktif Kaspaz-3 seviyesinde anlamlı bir değişiklik olmaması apoptotik hücre ölümünün çok fazla olmadığını göstermektedir. Beclin-1'deki anlamlı azalış hücrelerin otofojik yolla ölmeyebileceğini gösterirken, MiaPaca-2 hücrelerinde ölçülen LDH seviyesi ile ölen hücrelerin bir kısmının da nekroz ile öldüğünü göstermektedir. INS-1 hücrelerinde eksozom uygulaması sonrası insülin seviyesinin anlamlı bir şekilde artması eksozomların insülin mekanizmasına etki ederek üretimini artıdığını gösterirken, insülin sekresyonunda bir değişiklik olmaması eksozomların insülin salınımına etki etmediğini ya da fazla üretilen insülinin salınımı sırasında sorunlar olabileceğini göstermektedir.

Özet (Çeviri)

The pancreas consists of two parts, endocrine and exocrine. While the exocrine pancreas includes acinar and canal cells, the endocrine pancreas consists of the Langerhans islet which has five different types of cells. Pancreas cancer is one of the deadliest malignant neoplasms and the leading cause of death because of cancer. The annual survival rate is less than 5% for pancreatic cancer, which is also late in its diagnosis due to the fact that the symptoms occur at the advanced stage and are not distinguishing. A stem cell has the capability of sellperpetuation, clonality, and differentiation and it plays a role constitution of tissue and organ in the embryonic and fetal period, it is also effective in regeneration in the adult period. Mesenchymal stem cell which is one of the adult period stem cells has the capability of antiinflammatory, immunoregulatory, and immunosuppressive. Pancreatic islet-derived progenitor cells (PID-PC) has also properties of typically mesenchymal stem cells. The size of exosomes is 50- 150 nm, and are vesicles encased in a lipid bilayer. These vesicles that its effective cell-to-cell communication differs from other vesicles due to their RNA cargo contents. The fact that they can cause changes in the target cell by carrying miRNA and mRNA from the cells they are secreted suggests that exosomes may play a role in the diagnosis and treatment of many different diseases, especially cancer. The purpose of our study is to characterize exosomes isolated from the PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1 cell lines and make an analysis comparatively of the size of this exosome for the first time. Besides, the second aim of this study is to research the effects of exosomes which were first time isolated from PID-PC on the INS-1 cells, which is a beta cell tumor, and MiaPaca-2 cells which is a pancreatic cancer EFFECTS OF EXOSOMES ISOLATED FROM PID-PCs ON PANCREATİC CANCER xx cell line. Exosomes were isolated from all three cell lines with exosome isolation kits. Alix, TSG101, CD9, and CD81 proteins which are known as markers for exosomes were analyzed with Simple Wes in cell lysates which were obtained from the three cell lines and also exosomes isolated from cell lines. The size and concentration of exosomes that were isolated from three different cell lines were detected with Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The cell viability test (MTT) was done and IC50 values were detected after exosomes were isolated from PIDPC and characterized and also applied to INS-1 and MiaPaca-2 cell lines in which concentrations of 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 and 10 µg/ml for 24 and 72 hour. The cells were fixed and were marked immunohistochemically with HSP90, HSF-1, Nestin, Endoglin, Kaspaz-8, Active Kaspaz-3, Beclin, and p-Bcl-2 antibodies after exosomes were applied with determined IC50 value in INS-1 and MiaPaca-2 cell lines for 72 hours. The labeling intensities of the proteins were calculated using the computer-aided image analysis program NIS-Element D 3.1 under the light microscope. The cell cytotoxicity was measured by using an LDH kit after exosomes were applied with a determined IC50 value in the MiaPaca-2 cell line for 72 hours. Moreover, to investigate the functional effect of exosomes on the INS-1 cell line, cell secretion was collected, and cell lysates were obtained after exosomes were applied with a determined IC50 value in INS-1 for 72 hours. Insulin levels were analysed at by using an Insulin ELİSA kit in the obtained cell lysates and secretion. As a result of Simple Wes analysis, Alix protein was detected in exosomes isolated from PIDPC, MiaPaca-2, INS-1, and cell lysates obtained from MiaPaca-2, INS-1. TSG101 proteins were detected in cell lysates obtained from PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1, but not isolated exosomes. CD9 protein was shown in PID-PC, MiaPaca-2, and INS-1 cell lysates and exosomes isolated from INS-1. On the other hand, CD81 protein was detected only in lysate obtained from the MiaPaca-2 cell line. As a result of NTA, the dimensions of exosomes isolated from PID-PCs as 103.6 ± 28.6 nm, exosomes isolated from MiaPaca-2 cell line as 100.7 ± 10 nm, and exosomes isolated from INS-1 cell line as 147.2 ± 12.3 nm were analyzed. According to cell viability analysis, incubation of MiaPaca-2 cells with exosomes isolated from PID-PCs for 24 hours was not statistically significant compared to the control group at low concentrations of exosome application. As a result of the incubation of MiaPaca-2 cells with isolated exosomes for 72 hours, a decrease in cell viability occurred beginning from low doses. In the INS-1 cell line, there was no difference in cell viability compared to the control until the application of the exosome at a concentration of 5 µg/ml after 24 hours of incubation with the exosome. As a result of incubation of INS-1 cells with exosomes for 72 hours, no change was observed until the application of exosomes at a concentration of 2.5 µg/ml, while cell viability began to decrease as a result of exosome application at higher doses. According to the results of immunohistochemical staining, the immunostaining intensity of HSP90 when exosome was applied to the INS-1 cell line was not statistically significant compared to the control group, while the immunostaining intensity of HSP90 increased significantly in MiaPaca-2 cell line, which was applied to the exosome, compared to the control group. In addition, the HSP90 immunostaining intensity of the MiaPaca-2 cell line was significantly higher than the INS-1 cell line in the exosome-treated groups of both cell lines. While there was no statistically significant difference in HSF-1 immunostaining intensity in the exosome-treated INS-1 and MiaPaca-2 cell lines compared to the control group, the HSF-1 immunostaining intensities were significantly higher in the control group of MiaPaca-2 cell line xxi compared to the control group of the INS-1 cell line, and also the exosome-treated MiaPaca-2 cell line compared to the exosome-treated INS-1 cell line. There was no significant difference in Nestin and Endoglin immunostaining intensity in INS-1 and MiaPaca-2 cell lines treated with and without exosomes. As a result of Nestin immunostaining, there is no labeling of Nestin protein in the control group of both cell lines. Similarly, as a result of Endoglin immunostaining, there was no labeling of Endoglin protein in the INS-1 cell line both in the control group and in the exosome treated group, and in the MiaPaca-2 cell line only in the control group. In the Miapaca-2 cell line, Caspase-8 and Active Caspase-3 immunostaining intensities were not different in the exosome-treated group compared to the control group. There was a statistically significant decrease in Beclin and p-Bcl-2 immunostaining intensities in the exosome-treated MiaPaca-2 cell line compared to the control group. After exosome application to the MiaPaca-2 cell line, the level of LDH released from the MiaPaca-2 cell line was analyzed as 13.98 ± 3.361% and cell cytotoxicity was determined. According to the insulin levels measured with the ELISA kit in the cell secretion and lysate of the exosome-treated INS-1 cells, the insulin level in the cell lysates increased statistically significantly compared to the control group. However, the level of insulin in cell secretion did not differ compared to the control group. In addition, insulin levels in exosome-treated INS-1 cell lysates showed a statistically significant increase compared to cell secretion. As a result, we saw that the exosomes isolated from PID-PC, MiPaca-2, and INS-1 cell lines for the first time by us and whose size analyses were performed, were similar according to the exosome sizes isolated from different sources in the literature. We observed that the Alix protein may be a specific marker for exosomes isolated from the three cell lines and the CD9 protein may be a specific marker only for INS-1 isolated exosomes. In cell viability analysis, we detected that exosome isolated from the PID-PC cell line caused cell death in the MiaPaca2 cells in a time- and dose-dependent manner. In addition, the IC50 value determined for MiaPaca-2 cells has no effect on cell viability in INS-1 cells, which best mimics pancreatic beta cells and can be used instead of healthy pancreatic beta cells in some studies, suggesting that isolated exosomes can kill cancer cells without damaging healthy cells. The significant increase of HSP90 in the MiaPaca-2 cell line as a result of immunostaining suggests that the increase of this protein may be a marker in the case of possible exosome treatment in pancreatic cancer. A significant decrease in the p-Bcl-2 level in the MiaPaca-2 cell line indicates that cells can die in an apoptotic way, while a significant change in the Active Caspase-3 level indicates that apoptotic cell death is not too much. While the significant decrease in Beclin-1 indicates that the cells may not die autophagically, the LDH level measured in MiaPaca-2 cells indicates that some of the cells that die also die by necrosis. A significant increase in insulin level after exosome administration in INS-1 cells indicates that exosomes increase their production by affecting the insulin mechanism, while the absence of a change in insulin secretion indicates that exosomes do not affect insulin secretion or that there may be problems during the release of excess insulin.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    868166

    Çift hedefli biyouyumlu nanopartiküllerin pankreas kanseri üzerine etkisi

    The effect of the dual-targeting biomimetic nanoparticles on pancreatic cancer

    AYŞE NUR NURDOĞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYŞE KARATUĞ KAÇAR

  2. Tez No

    569880

    Pankreatik beta hücre farklılaşmasında moleküler enerji algılayıcıları ve metabolik değişimlerin rolü

    The role of molecular energy sensors and metabolic changes in pancreatic beta cell differentiation

    ERTAN ÇELİK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Biyokimyaİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SELDA OKTAYOĞLU

  3. Tez No

    258842

    PWM yöntemi ile DC motorun PC üzerinden kontrolü

    The controlling of DC motor on PC by using PWM method

    ERDOĞAN ÖZEL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2009

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiYüzüncü Yıl Üniversitesi

    Elektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SABİR RÜSTEMLİ

  4. Tez No

    721194

    PID controller library for arduino

    Başlık çevirisi yok

    OĞUZHAN ÇAKIR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Bilgi ve Belge YönetimiPolitecnico di Milano

    DOÇ. DR. ALBERTO LEVA

  5. Tez No

    270417

    PID controller design for asymmetrical temperature control

    Asimetrik sıcaklık kontrolünde PID kontrol tasarımı

    MEHMET SAİD YÜKSELTEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolBoğaziçi Üniversitesi

    Sistem ve Kontrol Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. EŞREF EŞKİNAT

Geri Dön